维生素C二步发酵两菌关系的研究进展

维生素C生产菌株酮古龙酸杆菌与蜡状芽孢杆菌存在较为复杂的两菌关系,为系统优化发酵过程带来困难。系统梳理维生素C二步发酵两菌关系的最新研究进展。     

产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定

从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定。结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4 U/mL~10.4 U/mL之间。经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌。     

蜡状芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化

为提高蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)发酵产蛋白酶的能力,对发酵培养基组成及培养条件进行优化。通过单因素试验研究最适C源及其添加量、最适N源及其添加量、温度、种龄、摇床转速、装液量、pH、时间、接种量等条件对菌株产蛋白酶的影响。在此基础上,利用正交试验设计从9个影响因素中筛选3个主要影响因素,即蛋白胨添加量、温度和装液量;再利用Box-Behnken试验设计进行响应面分析,最终确定蜡状芽孢杆菌发酵产酶条件的最优条件为:蛋白胨添加量7.9g/L,温度26.7℃,装液量56.4mL。优化后,蛋白酶活力达到753.67U/mL,比初始蛋白酶活力(249.50U/mL)提高了2.02倍。     

紫外诱变芽孢杆菌选育木聚糖酶高产菌株

以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）为出发菌株，采用紫外诱变的方法获得了2株木聚糖酶高产菌株，酶活分别是原来的17．50倍和17．20倍。选取酶活最高的菌株进行发酵条件的研究。     

木聚糖酶合成菌株的诱变选育

以黑曲霉、蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌为出发菌株,采用紫外物理诱变及紫外物理诱变和紫外亚硝酸复合诱变的方法,选育培养出产木聚糖酶酶活较高的菌株。经过紫外诱变后黑曲霉菌株所产酶酶活为17.3716U/ml;经过复合诱变后黑曲霉菌株所产酶酶活为15.2144U/ml。经过紫外诱变后枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌菌株所产木聚糖酶酶活分别为16.1328U/ml和13.7200U/ml。     

中温大曲中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选鉴定及培养条件优化

为了获得高产淀粉酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）,该研究采用稀释平板法和划线法从中温大曲中分离纯化芽孢杆菌,通过透明圈法初筛和3,5二硝基水杨酸（DNS）法复筛,获得高产淀粉酶芽孢杆菌,并采用形态学观察和16S r RNA同源序列分析方法进行菌种鉴定。以淀粉酶活力为响应值,采用单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验对筛选菌株的培养条件进行优化。结果表明,共分离纯化出72株芽孢杆菌,从中筛选得到一株淀粉酶活力最高的芽孢杆菌菌株,编号为ZTW17-6,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）;其最佳培养条件为乳糖50 g/L、蛋白胨60 g/L、接种量5%、发酵温度35℃、转速180 r/min、装液量76 m L/250 m L、初始pH值7。在此优化条件下,淀粉酶活力达到8 352.95 U/m L,是优化前的2.61倍。     

浓香型大曲中蛋白酶产生细菌的分离鉴定

从浓香型大曲中分离纯化得到5株产蛋白酶细菌,对其进行了生化分析,结合《伯杰细菌鉴定手册》对这5株细菌的鉴定。鉴定结果为：A苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）;B枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;C蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）;D多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）;E枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对产酶能力最强的C菌株用Biolog微生物自动分析系统进行鉴定,鉴定结果与生化鉴定结果相符合。     

N~+注入诱变选育β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株及其发酵条件优化

以一株产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的蜡状芽孢杆菌BC-0801为出发菌株,利用10keV,剂量为40×2.5×1013ions/cm2氮离子进行诱变选育,获得一株高产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的突变体BC-0802。对该突变体BC-0802发酵培养基的碳源、氮源及无机离子进行单因素试验分析,采用3个因素正交试验确定其最佳发酵培养基成分质量浓度及发酵条件为:玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO41g/L,发酵温度30℃、pH 9.0、接种量2%、发酵周期36h。结果表明;突变体的平均酶活力可达3415.8U/mL,相较于出发菌株酶活力提高了3.67倍,且该突变体的遗传稳定性较好。     

蚕豆酱传统酿造过程中细菌菌群的动态变化

蚕豆酱传统酿造过程中微生物的动态变化对其产品的成熟、风味形成及食品安全具有重要影响。为了有效分析蚕豆酱的传统日光暴晒酿造过程中菌种的动态变化,作者采用菌株专一性的Rep-PCR指纹技术,分析可培养细菌菌种在酿造过程中的定量变化,并分离鉴定优势菌株。结果表明,日光暴晒的传统酿造过程中,好氧细菌总数均在较高水平,为107~108CFU/g,主要为芽孢杆菌属,包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)。兼性厌氧菌的数量在103~104CFU/g,主要是是蜡状芽孢杆菌(B.cereus)。发酵前期枯草芽孢杆菌为优势菌,占80%以上,到发酵后期,淀粉液化芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌含量增多。所以,该蚕豆酱传统酿造过程中,芽孢杆菌起到主要的作用;此外,蜡状芽孢杆菌含量较多,这与敞开式发酵相关,但与好氧菌相比,其数量保持较低水平,表明其生长受到一定抑制,从而能够保证这一传统发酵食品的安全性。     

异甘露聚糖酶生产菌的诱变育种及固态发酵条件的优化

为了提高异甘露聚糖酶活性,对实验室保藏的一株分泌异甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)进行紫外诱变育种,并优化一株正突变株的固态发酵条件。出发菌株枯草芽孢杆菌K-6的酶活力为206.0U/mL,经紫外线诱变处理后,挑选在培养基上透明水解圈较大的菌株进一步复筛,获得枯草芽孢杆菌K-6-9高产突变株,酶活力为349.3U/mL,高于出发菌株69.6%。连续5代发酵,K-6-9的酶活力范围为343.0～350.3U/mL,表明该突变菌株产酶性能稳定。以K-6-9为菌种,采用单因素试验和正交试验进行最佳固态发酵产酶条件的优化,结果表明：该突变株的固态发酵适宜发酵条件为：发酵时间72h、接种量3%、初始pH 7.5、装料量25g/250mL;培养基组成为：酵母细胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麸皮添加量40%,此优化条件下固态发酵K-6-9菌株产酶酶活力最高达601.6U/mL。     

纳豆菌的分离、鉴定及产蛋白酶液态发酵条件的优化

利用奶粉豆粕培养基,采用稀释平板分离法,以H/C(透明圈直径/菌落直径)为指标,从日本传统食品纳豆中分离出9株蛋白酶产生菌。将这些初筛菌株进行发酵培养,采用Folin-酚法测定酵上清液的蛋白酶活性,选出蛋白酶活性最高的菌株H2,并依据形态特点和主要生理生化特征,鉴定为芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillussubtilis sub.Natto)。最后以蛋白酶活性为指标,考察培养基初始pH值、温度、装液量、接种量和种龄等因素对H2菌株液态发酵的影响。结果表明,该菌株液态发酵产蛋白酶的适宜条件是:培养基初始pH值7、培养温度40℃、装液量40 mL/250 mL、接种量3%、种龄25 h。     

固态发酵玉米黄粉饲料复合菌种的筛选

运用平板点种法、点种刺激圈法和多菌种固体发酵法3种主要方法,筛选发酵玉米黄粉饲料的复合菌株。结果表明,枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）和地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）3种菌株以1∶1∶1的比例混合,按5% 的接种量接入发酵培养基,发酵效果较好,于30 ℃条件下发酵120 h,玉米黄粉饲料中可溶性蛋白含量由3.78%提高到14.26%。     

高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵产物分析

该试验从高温大曲中筛选产吡嗪芽孢杆菌（Bacillus）,通过形态观察及磷脂脂肪酸（PLFA）分析对其进行鉴定,并采用发酵试验分析其代谢产物。共筛选出3株芽孢杆菌,即菌株B1、B2、B3。经分析鉴定后得出：菌株B1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）;菌株B2和B3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。3株菌发酵产物分析结果表明,在液态发酵条件下3株菌发酵产吡嗪,其中菌株B2和B3发酵产物中吡嗪相对含量较高,均＞60%;固态发酵条件下生成吡嗪前体物质3-羟基-2-丁酮,且发酵产物中相对含量均＞75%。表明这3株芽孢杆菌对酱香型白酒风味物质的产生有着一定的影响。     

海洋中产胆固醇氧化酶细菌的筛选及其发酵条件优化

利用菌落染色法从海洋中分离、筛选高产胆固醇氧化酶的菌株,所得菌株经分子生物学技术进行鉴定,采用单因素试验对其产酶条件进行优化,并利用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析法对酶进行分离纯化。结果表明,以胆固醇为唯一碳源,筛选出具有高胆固醇氧化酶活性的菌株XLH059,酶活力为0.407 U/m L;菌株XLH059被鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus);菌株XLH059的最佳产酶条件为发酵周期24 h,发酵温度26℃,接种量10%,初始pH值7.0,装液量100 m L/250 m L,转速200 r/min,最佳碳源和氮源分别为葡萄糖和蛋白胨,胆固醇含量0.5%。在此优化条件下,胆固醇氧化酶活力为0.72 U/m L,是优化前的1.76倍;经分离纯化获得分子质量约为59 kDa的胆固醇氧化酶。     

产γ-PGA的菌种筛选及发酵条件的优化

目的从不同的豆类发酵食品中分离筛选产γ-多聚谷氨酸的高产菌株,并优化其发酵条件。方法通过菌株的分离初筛、形态观察、生理生化特性分析、DNA序列测定以及系统发育树分析鉴定菌株。经测定发酵曲线,并设计以发酵温度、转速、装液量、接种量为试验因素的L_9(3~4)正交试验优化其发酵条件。结果菌株A_5与枯草芽孢杆菌的特性相似,由基因序列同源性比对结果可知,该菌与菌株编号为FJ441062枯草芽孢杆菌的同源性最高,达到99.0%,所筛选的菌株A5鉴定为枯草芽孢杆菌。确定其适宜的发酵条件为:温度30℃,初始pH为6.0,接种量2%,转速200 r/min,培养时间72 h。优化发酵条件后,γ-PGA产量为12.12 g/L。结论枯草芽孢杆菌A_5能够发酵产生γ-多聚谷氨酸,培养条件对γ-多聚谷氨酸的产量影响很大。     

食（药）用蕈菌中高抑菌活性菌株筛选及培养基优化

对4个不同属24株食(药)用蕈菌对11株指示菌抑菌活性进行研究,通过初筛模型,从中筛选出3株功能菌,6株指示菌。对初筛菌株进一步复筛,确定功能菌株H2与枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌为培养基优化的出发菌株和指示菌。通过响应面分析优化培养基配方,结果表明,当麦芽糖40.9g/L、蛋白胨11.2g/L、KH2PO4 2.1g/L、MgSO4 ·7H2O 1.1g/L时,H2对枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌的抑菌活性均较理想,其抑菌圈半径分别达到3.513、4.610、8.800mm。     

一株高产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离及产酶条件优化

为了分离筛选高产纤维素酶活性菌株以为食品工业所用,从发酵豆制品及土壤中分离到21株革兰氏阳性细菌,并在含羧甲基纤维素钠琼脂培养基中培养24h,经刚果红染色、盐水脱色后5株细菌菌落周围可形成透明圈,其中以豆豉源F3菌株形成的透明圈与菌落直径比值最大,即纤维素酶活性最高。F3菌株经形态学特征及16S rDNA与gyrB基因序列比对分析,鉴定为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)。通过单因素试验及正交试验对F3菌株液体发酵产纤维素酶条件进行了优化,确定了其产纤维素酶的最佳条件:培养基初始pH为pH7.0,接种量6%,培养温度37℃,培养时间60h,纤维素酶活力可达21.14U/mL。解淀粉芽孢杆菌F3菌株的酶学性质及其对豆豉营养价值及品质的影响仍有待于进一步深入研究。     

哈密瓜中内生细菌的分离与鉴定

为了解哈密瓜内生菌的生物多样性,采用组织块培养法,从新疆哈密瓜的不同组织部位分离内生细菌,经纯化后得到21株内生菌,其中源自瓜皮的菌株5株,浅层肉4株,深层肉4株,瓜瓤2株,瓜籽6株,以瓜籽中分离的最多,占总菌数的28.6%。通过形态和分子鉴定,确定所分出的菌株皆为细菌,且均为芽孢杆菌,其中解淀粉芽孢杆菌3株,甲基营养型芽孢杆菌2株,多粘类芽孢杆菌2株,蜡状芽孢杆菌1株,特基拉芽孢杆菌2株,枯草芽孢杆菌最多,为11株,占总菌数的52.4%。哈密瓜内生菌的分离鉴定,为进一步研究哈密瓜内生菌与宿主的关系及内生菌的应用奠定基础。     

产蛋白酶兼性厌氧菌株的筛选、酶学性质及发酵豆粕应用探究

为筛选得到1 株或几株深层发酵豆粕效果较好的菌株,以透明圈法从自然发酵的豆豉中筛选出4 株兼性厌氧且产蛋白酶菌株,同时发现菌株B-1、B-12在厌氧条件下产蛋白酶能力好于好氧条件,对此现象较明显且平板水解圈直径较大的菌株B-1进行形态学、生理生化和分子生物学实验,鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。进一步对菌株B-1的蛋白酶酶学性质进行研究后发现,酶活力在pH 6.0～9.0的范围内能够维持一个较高的水平,酶反应和酶稳定最适条件为pH 7.0和40 ℃,加入Mn2+对酶反应的促进作用较大。将甲基营养型芽孢杆菌B-1以6%的接种量接种于豆粕固态发酵培养基中堆积（20 cm）发酵,以枯草芽孢杆菌A-12好氧浅层发酵和未发酵豆粕作为对照,发酵结束后测得豆粕中小肽含量和水解度分别高达28.37%和29.55%,比枯草芽孢杆菌固态发酵对照组分别高出了9.04%和16.07%,与未发酵豆粕相比,菌株B-1发酵后豆粕的小肽含量和水解度也分别提高了27.22%和29.13%。     

枯草芽孢杆菌产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇发酵条件优化

研究以一株从古井窖泥中分离筛选的枯草芽孢杆菌为出发菌株,进行发酵培养成分和发酵条件优化。与静置发酵相比,振荡培养可有效提高菌株发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的产量;在振荡培养的基础上采用正交试验方法对发酵培养基和培养条件进行了优化。实验结果表明,枯草芽孢杆菌发酵培养的最佳条件为:3mmol/L Mg~(2+),15g/L蛋白胨,150r/min,32℃。与初始静置发酵条件相比,最优条件下3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇(左旋)、2,3-丁二醇(内消旋)的产量分别提高了57.75%、1234.96%、163.33%。