重组蜂毒素-基因变构IL-2的纯化与生物活性

目的制备纯化重组蜂毒素-基因变构IL-2(Melittin-88ArgIL-2)嵌合蛋白,并检测其生物活性。方法将含表达载体的大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达。表达产物经离子交换层析与亲和层析进行纯化,SDS-PAGE鉴定,MTT染色法检测嵌合蛋白对Hela细胞增殖的抑制作用。结果所表达的可溶性蛋白,纯化后纯度达95%,蛋白浓度0.5g/L。纯化后的嵌合蛋白在体外能抑制Hela细胞的增殖。结论已成功地制备并纯化了重组melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白,该蛋白具有生物活性,为中试放大和纯化工艺研究奠定了基础。     

重组小鼠IL-33蛋白的原核克隆表达、纯化及生物学活性检测

目的:克隆鼠源白细胞介素33(murine interleukin-33)基因,构建大肠杆菌表达菌株,并对纯化后的蛋白进行生物活性的初步测定。方法:采用质粒抽提技术从大肠杆菌中提取质粒,构建p ET-32a-IL-33重组质粒;通过发酵罐培养技术获得蛋白,亲和层析方法纯化目的蛋白;ELISA检测纯化蛋白IL-33诱导产生TNF-α。结论:成功构建出鼠源IL-33的原核表达载体,成功表达出IL-33,IL-13能诱导TNF-α细胞因子的产生。     

A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化

目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。     

人LNα4链LG3-4组件的优化表达及活性检测

目的优化人层粘连蛋白α4链LG3-4组件基因在大肠杆菌中的表达条件。方法分别从诱导温度、诱导时间、IPTG浓度等方面进行优化。表达产物经Ni-NTA介质纯化,MTT法检测目的蛋白对人肺癌A549细胞粘附及增殖功能的影响。结果在20℃下,1mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白呈最佳可溶性表达;在37℃下,2mmol/L的IPTG诱导4h,呈最佳包涵体形式表达。纯化后目的蛋白纯度达96%,且具有良好的增强人肺癌A549细胞伸展和粘附的功能。结论已确立了hLNα4LG3-4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件。     

犬干扰素α的原核表达及其抗病毒活性

目的原核表达犬重组干扰素α(rCaIFNα),并检测其抗病毒活性。方法PCR扩增CaIFNα成熟蛋白基因,并克隆至pGEX-5X-1表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定,并检测其效价及抗犬细小病毒活性。结果PCR、双酶切及序列分析证实CaIFNα成熟序列已插入pGEX-5X-1载体中。表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约45000的目的蛋白条带,表达量约占菌体总蛋白的(32±2.4)%。纯化的重组蛋白纯度约为85%,且具有良好的反应原性。制备的3批rCaIFNα效价均达到1.1×106IU/ml以上。并可抑制犬细小病毒对MDCK细胞的致病变作用。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了rCaIFNα,表达产物具有良好的抗病毒活性。     

人松弛素H2类似物在毕赤酵母中的高效表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统高效分泌表达人松弛素H2类似物(Human relaxin-2 analogue,HR2),并检测其生物活性。方法通过密码子优化合成HR2基因,构建重组表达质粒pPICZαA-HR2,转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。表达产物经超滤和柱层析纯化后,切除人工C肽,检测其生物活性。结果经双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pPICZαA-HR2构建正确;Tricine-SDS-PAGE分析显示,表达的重组蛋白相对分子质量约6 500,表达量占菌体总蛋白的47.6%,为451μg/ml,且为分泌表达;Western blot分析显示,重组蛋白具有良好的反应原性;纯化的重组蛋白纯度达96%;经检测C肽切除的重组HR2对THP-1细胞具有刺激活性。结论成功在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了重组松弛素H2类似物,并具有一定的生物活性。     

重组小肿瘤坏死因子α拮抗剂的表达、纯化及其生物学活性

目的表达能够与肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)结合的低相对分子质量重组小肿瘤坏死因子α拮抗剂(small TNFαantagonist,STNFαA),并对纯化后蛋白的生物学活性进行检测。方法利用计算机模拟优化设计出与TNFR1具有较高结合力的STNFαA氨基酸序列,根据大肠埃希菌"密码偏爱性"设计合成目的基因,插入质粒pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-STNFαA,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定后,采用Ni Sepharose 6 Fast Flow层析介质进行亲和纯化,纯化产物经SDSPAGE、HPLC分析;采用MTT法检测重组蛋白的生物学活性。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;重组蛋白STNFαA相对分子质量约17 000,表达量约占菌体总蛋白的25%,以包涵体形式存在,纯度大于95%;重组蛋白STNFαA对TNFα的抑制作用呈浓度依赖性。结论已成功表达了STNFαA,该蛋白具有抑制TNFα介导的细胞毒生物活性作用,为全新的TNF拮抗剂的新药研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。方法将ESAT-6基因自pET-24b-ESAT-6质粒亚克隆至pGEX-3C载体中,构建重组表达质粒pGEX-ESAT-6,经酶切及测序鉴定正确后,分别转化大肠杆菌JM107和BL21(DE3),以不同浓度IPTG诱导表达,表达产物经GSH-Sepharose4 B亲和层析纯化。结果所构建的重组表达质粒pGEX-ESAT-6经酶切及测序鉴定正确;重组融合蛋白在大肠杆菌JM107中的表达量较高,可达菌体总蛋白的24.2%;最适IPTG诱导浓度为0.1mmol/L;纯化的目的蛋白纯度可达83.9%。结论已成功构建了重组表达质粒pGEX-ESAT-6,并在大肠杆菌JM107中高效表达,为结核分枝杆菌亚单位疫苗及核酸疫苗的研制提供了材料。     

猪白细胞介素-2基因的原核表达、纯化及其生物学活性

目的原核表达、纯化猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),并检测其生物学活性。方法以提取的猪外周血淋巴细胞基因组RNA为模板,PCR扩增猪IL-2基因,插入原核表达载体pBV220,构建重组表达质粒pBV220/IL-2。将重组表达质粒转化感受态大肠埃希菌DH5α,经含Amp的LB平板筛选后,将重组菌于LB培养液中培养,分别于不同培养时间进行活菌计数,绘制重组菌的生长曲线;42℃诱导表达重组蛋白,经尿素纯化后,采用CTLL细胞/MTT比色法检测其生物学活性。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;重组菌的最佳开始诱导时间为重组菌发酵培养10 h;重组蛋白相对分子质量约17 400,表达量占菌体总蛋白的19%,纯化后纯度达95%;重组蛋白的生物学活性可达3×105IU/ml。结论原核表达并纯化了具有生物学活性的重组猪IL-2蛋白,为其进一步研究和产业化生产奠定了基础。     

九香虫CcPT1蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达九香虫Cc PT1蛋白，并进行纯化。方法 将合成的Cc PT1基因克隆至载体p GEX-4T-1，构建重组表达质粒p GEX-4T1-Cc PT1，转化感受态E. coli Rosetta，经IPTG诱导表达重组蛋白，并优化诱导表达的温度(20及37℃)、IPTG终浓度(0.25、0.5、0.75、1 mmol/L)及时间(6、8、10、12 h)。采用GST蛋白纯化系统纯化重组蛋白，纯化产物经10%SDS-PAGE分析及Western blot鉴定，纯化过程中采用Pre Scission Protease去除GST标签。结果 重组蛋白GST-Cc PT1相对分子质量约为29 800，大小与预期相符，主要以包涵体形式表达，蛋白浓度为0.026 9 mg/m L。最适诱导条件为：20℃下，采用终浓度0.75 mol/L的IPTG诱导12 h。纯化蛋白纯度> 90%，且可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性结合。去除GST标签后的Cc PT1蛋白相对分子质量约为2 830，蛋白得率达11.15%。结论 经原核表达获得了纯度较高的九香虫Cc PT1蛋白，为九香虫抗癌肽的深入...     

小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定

目的应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠可溶性IL-5α受体(Soluble IL-5 receptorα,sIL-5Rα)蛋白,并对其抗原性进行鉴定。方法应用Vector NTI AdvanceⅡ软件优化小鼠IL-5Rα基因胞外区密码子后合成序列,将sIL-5Rα克隆至pFastbacI中,构建重组穿梭质粒pFastbacI-sIL-5Rα,转化感受态大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆粒Bacmid-sIL-5Rα,转染sf9细胞,通过异源基因重组获得杆状病毒,采用Reed-Muench法检测扩增后病毒滴度;将P3、P4代病毒以0.05 MOI感染sf9细胞,SDS-PAGE鉴定sIL-5Rα蛋白的表达,表达产物应用阳离子交换层析法进行纯化,并对纯化的sIL-5Rα蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组杆粒Bacmid-sIL-5Rα经PCR鉴定,证明构建正确;P3代重组杆状病毒的病毒滴度为1.7×107pfu/ml;表达及纯化的sIL-5Rα蛋白在相对分子质量约43 000处可见特异蛋白条带,感染的sf9细胞裂解上清可与兔抗小鼠IL-5Rα多克隆抗体发生特异性反应。结论Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小鼠可溶性IL-5Rα受体蛋白,为进一步研究其生物学功能及在哮喘模型动物中的治疗作用奠定了实验基础。     

小鼠可溶性IL-5受体α胞外区基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达小鼠可溶性IL-5受体α(sIL-5Rα)胞外区基因。方法采用RT-PCR从BALB/c小鼠脾脏组织中分别扩增sIL-5Rα胞外区前后段基因片段,酶切后将两段基因连接,插入原核表达载体pPROEX中,构建重组表达质粒pPROEX/sIL-5Rα,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达。结果重组表达质粒经双酶切和DNA测序,证实构建正确。表达的sIL-5Rα胞外区蛋白相对分子质量约36100,表达量约占菌体总蛋白的30%,且可与兔抗小鼠sIL-5Rα单抗发生特异性免疫反应。结论已成功克隆并原核表达了小鼠sIL-5Rα胞外区基因,为进一步探讨sIL-5Rα对哮喘的治疗作用及开发新的哮喘治疗药物奠定了基础。     

人IL-23R胞内区基因的克隆与原核表达

目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法通过PCR获得hIL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760bp的目的片段。重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为55000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功克隆了hIL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GST融合蛋白。     

重组人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达及生物学活性分析

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10),并检测其生物学活性。方法将IL-10基因重组到质粒pET11c中,转化BL21(DE),提取质粒,经酶切鉴定和测序分析;在25℃用低浓度的IPTG诱导表达,对包涵体IL-10稀释复性;经ELISA检测其含量,MC/9细胞增殖法检测其生物学活性。结果工程菌IL-10/pET11c/BL21诱导表达的目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,Westernblot鉴定证实为IL-10蛋白,两种形式的IL-10均具有一定的生物学活性。结论已成功地在大肠杆菌中表达了IL-10,为进一步纯化和制备IL-10的基因工程药物打下了基础。     

重组人B7-H1IgV发酵纯化工艺的建立及其抑瘤活性

目的建立大规模生产重组人B7-H1IgV(rhB7-H1IgV)的发酵和纯化工艺,并检测纯化蛋白的抑瘤活性。方法对rhB7-H1IgV工程菌进行发酵培养,IPTG诱导表达,采用超声裂菌分离包涵体,梯度复性,2次Ni亲和层析等步骤纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE、Westernblot分析及抑瘤活性检测。结果在建立的发酵工艺下,rhB7-H1IgV的表达量可达菌体总蛋白的(10～11)%;纯化的rhB7-H1IgV蛋白经HPLC检测,纯度可达95%以上,Westernblot检测具有良好的反应原性;动物实验表明纯化的重组蛋白能诱导BALB/c小鼠产生高滴度的抗B7-H1抗体,且对肿瘤的生长具有明显的抑制作用。结论所建立的rhB7-H1IgV发酵纯化工艺简单迅速,为其开发和应用奠定了基础。     

TRAIL_(114～281)-IL-24融合蛋白的原核表达及其体外抗肿瘤细胞活性

目的原核表达肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)114～281肽和人白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)融合蛋白,并检测其体外抗肿瘤细胞活性。方法以人外周血单个核细胞总RNA为模板,PCR扩增TRAIL114～281和IL-24基因,经T4DNA连接酶连接成融合基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a/TRAIL114～281-IL-24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白TI经层析法纯化后,进行Western blot分析,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,caspase3活性检测试剂盒检测其对不同肿瘤细胞caspase3活性的影响。结果重组表达质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;TI融合蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度可达95%,且可与鼠抗人IL-24抗体发生特异性反应;经复性的蛋白能明显抑制人宫颈癌上皮细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并显著提高肿瘤细胞的caspase3活性。结论已在大肠杆菌中表达了TRAIL114～281-IL-24融合蛋白,其具有诱导部分肿瘤细胞凋亡的活性。     

人T淋巴细胞CD3ε链的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人T淋巴细胞CD3ε(hCD3ε)链。方法以健康成人外周血单个核细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增人CD3ε链基因,并克隆入pCR-II载体,酶切鉴定及测序分析后,再定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-hCD3ε,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果酶切分析及DNA测序证实,hCD3ε链基因被正确克隆入pGEX-4T-3载体,并能在原核系统中稳定表达。表达产物的相对分子质量为49 500,0.2 mmol/L IPTG 25℃诱导表达4.5 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的29.3%,其中可溶性表达占12.8%。纯化的融合蛋白纯度可达86.1%,可分别被兔抗人CD3ε多抗和羊抗GST多抗识别。结论已成功地原核表达并纯化了GST-hCD3ε融合蛋白。     

小鼠白细胞介素-13受体α2胞外区的原核表达与纯化

目的原核表达并纯化小鼠白细胞介素-13受体α2胞外区(sIL-13Rα2)。方法将sIL-13Rα2基因克隆入原核表达载体pROEXHTa,构建重组表达质粒pROEXHTa/sIL-13Rα2,经双酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。薄层扫描分析目的蛋白的表达量,并对其进行表达形式分析及Westernblot鉴定。镍柱亲和层析纯化目的蛋白。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确。表达的sIL-13Rα2蛋白相对分子质量约为36200;诱导6h,重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的45%;重组蛋白以包涵体形式存在,可与大鼠抗小鼠sIL-13Rυ2单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度大于95%。结论已成功表达并纯化了sIL-13Rα2,为进一步探讨其治疗支气管哮喘奠定了基础。     

云芝糖肽对乳腺癌患者外周血单个核细胞Toll样受体4的作用

目的探讨云芝糖肽(polysaccharopeptide,PSP)对乳腺癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell,PBMC)Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)的作用。方法体外分离乳腺癌患者或健康人PBMC,并将其分别分为PSP组(分别加入终浓度为25μg/ml的PSP和终浓度为100μg/ml的PHA)和对照组(只加入终浓度为100μg/ml的PHA),采用TLR4单克隆抗体对各组细胞进行免疫荧光染色。将乳腺癌患者PBMC分为空白对照组、TLR4抗体组、PSP组和PSP+TLR4抗体组,采用Q-PCR检测各组PBMC IL-12、IL-6和TNF-α的表达水平。结果健康志愿者对照组PBMC荧光强度较强,而健康志愿者PSP组PBMC荧光强度较弱;乳腺癌患者PSP组与乳腺癌患者对照组相比,细胞荧光强度更弱。与空白对照组比较,TLR4抗体组PBMC IL-12和组TNF-α的表达水平均显著降低(P<0.05),PSP组PBMC IL-12、IL-6和TNF-α的表达水平均显著上调(P<0.05或<0.01);与PSP和TLR4抗体组比较,PSP+TLR4抗体组PBMC IL-12、IL-6和TNF-α的表达水平均显著上调(P<0.05或<0.01)。结论 TLR4可能是PSP的作用受体之一。