黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在毕赤酵母中的高效表达

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2（成熟肽碱基）插入表达载体p PIC9K中,SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经MD平板、G418梯度和摇瓶复筛筛选出多克隆阳性转化子。选择28h的种子,每隔24h补加1.5%的甲醇,发酵96h后,比酶活可达13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为23.0ku;重组酶最适作用温度为45℃,最适作用p H为5.0,在温度35⁴0℃、p H5⁷条件下有良好的稳定性,Ca2+对酶的激活作用最明显。      

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在毕赤酵母中的高效表达

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2(成熟肽碱基)插入表达载体p PIC9K中,SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经MD平板、G418梯度和摇瓶复筛筛选出多克隆阳性转化子。选择28h的种子,每隔24h补加1.5%的甲醇,发酵96h后,比酶活可达13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为23.0ku;重组酶最适作用温度为45℃,最适作用p H为5.0,在温度35~40℃、p H5~7条件下有良好的稳定性,Ca2+对酶的激活作用最明显。     

巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达研究

经过近二十年的不断发展,巴斯德毕赤酵母表达系统目前已经被广泛的应用于外源基因的表达,并且获得巨大的成功。与其他表达系统相比而言,巴斯德毕赤酵母表达系统对营养物质要求低、基因组结构简单、可进行高密度发酵,这些优点在很大程度上促进外源基因的表达。但是,巴斯德毕赤酵母在外源蛋白表达过程中也存在许多问题,例如只能以甲醇作为唯一碳源、产热量高等,这些因素在一定程度上限制该表达系统的进一步应用。我们对巴斯德毕赤酵母表达系统进行系统的研究与分析,以期为提高外源基因在其中的表达量提供一定的借鉴。     

抗克伦特罗单链抗体在毕赤酵母GS115中的表达

构建表达抗克伦特罗单链抗体（CBL scFv）的毕赤酵母菌株,筛选高拷贝转化子并诱导CBL scFv在毕赤酵母中的分泌表达。将构建的含有CBL scFv基因的重组真核表达载体pPICZαA-CBL经BstX I酶切线性化后,利用电转化方法转化毕赤酵母菌GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性平板筛选高拷贝转化子,以甲醇诱导蛋白表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定及ELISA活性分析。结果显示,通过筛选出的重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为41kDa的蛋白,该蛋白可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为5.1ng/mL。经检测,重组抗体表达量为0.095g/L。这说明分泌表达CBL scFv的毕赤酵母菌株构建成功,为后期CBL scFv发酵与制备奠定了基础。      

抗克伦特罗单链抗体在毕赤酵母GS115中的表达

构建表达抗克伦特罗单链抗体(CBL scFv)的毕赤酵母菌株,筛选高拷贝转化子并诱导CBL scFv在毕赤酵母中的分泌表达。将构建的含有CBL scFv基因的重组真核表达载体pPICZαA-CBL经BstX I酶切线性化后,利用电转化方法转化毕赤酵母菌GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性平板筛选高拷贝转化子,以甲醇诱导蛋白表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定及ELISA活性分析。结果显示,通过筛选出的重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为41kDa的蛋白,该蛋白可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为5.1ng/mL。经检测,重组抗体表达量为0.095g/L。这说明分泌表达CBL scFv的毕赤酵母菌株构建成功,为后期CBL scFv发酵与制备奠定了基础。     

重组毕赤酵母GS115-Ch-Glu发酵亚麻籽脱毒工艺的优化

以重组毕赤酵母GS115-Ch-Glu为对象,进行亚麻籽发酵脱毒工艺的研究,以HCN脱除率为主要指标考察了毕赤酵母发酵亚麻籽脱毒影响关键的几个因素,包括接种量、温度、p H、水分、发酵时间,并在此单因素试验基础上对亚麻籽发酵脱毒进行正交试验。确定最佳发酵脱毒工艺条件为:接种量1.5%、温度28℃、p H 6.5、水分含量55%及发酵时间48 h。在此最佳条件下,HCN脱除率达97.0%以上,是目前已知微生物法亚麻籽脱毒的最高HCN脱除率。     

甜蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达及应用

巴西甜蛋白(Brazzein)是分离自非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon果实中的一种天然高倍甜味蛋白,具有较好的食品应用潜力。利用毕赤酵母GS115对巴西甜蛋白及蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)进行共表达,重组Brazzein在发酵液中分泌表达量为1 g/L。采用超滤-纳滤膜分离系统和冷冻干燥技术开发重组Brazzein的低成本制备工艺,并完成口感评价,甜度倍数为蔗糖的40倍。同时研究了重组Brazzein对常见致病菌和肠道益生菌的体外抑菌性能,结果表明,重组Brazzein对白念珠菌的最低抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为15 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC值为7.5 mg/mL,对桧状青霉的MIC值为3.75 mg/mL,对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌没有发现明显的抑菌效果。该研究为Brazzein在甜味剂方面的推广应用提供了理论研究基础。     

合成嗜热酸性淀粉酶的毕赤酵母表达

把密码子优化后的超耐热酸性α-淀粉酶的基因BD5088,引入载体pPIC9K中,将正确构建的重组质粒pPIC9K-BD5088转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,重组超耐热酸性α-淀粉酶PrBD5088在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外。该酶受甲醇的严格调控和诱导,在诱导培养5 d后酶活力达到最大值,表达量可达到约200 mg/L。与原核表达产物ErBD5088相比,PrBD5088的酶学性质发生了一定的改变。其最适反应温度由80℃增加到90℃。最适反应pH值仍为pH5.6,但范围更宽,在pH值5.0～6.5之间,其相对酶活在90%以上,在pH4.0～8.0范围内酶活性保留50%以上。而ErBD5088则只在pH5.0～7.0范围内能维持活性的50%以上。且PrBD5088的温度稳定性远高于ErBD5088。PrBD5088在100℃条件下热处理1 h仍具有80%以上的酶活力,而ErBD5088相同条件下的半衰期只有20 min。此外,Ca2+和Zn2+对维持rBD5088活性和稳定性会产生轻微促进作用,该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。SDS-PAGE测得该酶的分子量为56 ku,高于原核表达的酶蛋白。重组α-淀粉酶PrBD5088不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象。本实验结果表明O-连接糖基化可适当提高PrBD5088的热稳定性、最适温度和酸性pH条件下酶活性。     

构建人Cu,Zn-SOD毕赤酵母转化子及其高表达研究

设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷贝数提高2～8倍,活性检测显示提高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,其分子质量为40kD左右,低糖基化,均为分泌表达。Western blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定;Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好,表明构建了高表达菌株。     

巴斯德毕赤酵母表达人溶菌酶分批发酵工艺研究

对毕赤酵母表达重组人溶菌酶的诱导条件进行优化研究,采用恒溶解氧的分批补料发酵方式,确定甲醇诱导最适合的pH为4.5-5.5,最适合的表达温度为25℃,在细胞密度为OD600=400的条件下开始诱导,诱导60h后发酵上清液酶活力达到14013U/ml,为进一步的工业化生产奠定了基础。     

Production and optimization of a kiwi pectin methylesterase inhibitor in Pichia pastoris GS115

Gene sequence coding of a kiwi pectin methylesterase inhibitor was optimized, synthesized, and expressed in Pichia pastoris GS115 based on P. pastoris preferred codon usage. The expression level of the recombinant protein (kwPMEI) increased by 89.74% after codon optimization. Expression conditions of recombinant strains were optimized. The highest production of kwPMEI was achieved using 0.8% sorbitol (added every 24 h), 0.05% oleic acid (added at the beginning of induction), and 0.5% methanol (added every 12 h). kwPMEI was purified using Ni²⁺ chelating affinity chromatography and 17 mg of the protein was harvested from 60 mL of a culture supernatant. Activity analysis showed that kwPMEI efficiently inhibited the activity of different plant PMEs. High expression levels and purification of kwPMEI will promote applications in fruit and vegetable juices.     

菊粉酶基因重组酵母菌水解蔗糖的研究

表达蔗糖酶活性的菊粉酶基凶工程菌株GS115／INU1，经甲醇诱导发酵72h蔗糖酶活力为119．8U／mL。该酶水解蔗糖最适温度为55％、最适pH值为4．5。50％蔗糖溶液，加酶量12．0U／g底物、水解6h，蔗糖水解率达到89．5％。     

毕赤酵母基因工程菌高密度发酵产纳豆激酶条件研究

高密度发酵是提高发酵产量的一个非常有效的手段.通过摇瓶培养确定毕赤酵母基因工程菌(GS115/pPRONK1)生长和表达纳豆激酶的最优化条件,并在此基础上利用5 L发酵罐进行分批补料高密度培养,确定最适发酵条件,即接种量10%,发酵最适pH值为8.0,表达的最佳温度为25℃,甲醇诱导18 h后,纳豆激酶的最高活力达到6.5×104 U/L.     

重组毕赤酵母菌发酵木薯脱氰工艺的优化

木薯块根和皮中都含有有毒物质氢氰酸,在食品和饲料行业进行木薯产品加工之前都要进行脱毒处理,传统的浸水、晒干、烘干和水煮等方法在脱毒效率、成本以及溶剂残留等方面显得不尽人意,这就使得木薯在食品和饲料行业的广泛应用大受限制,因此寻找一种高效安全的脱毒方法应用在木薯产品的加工中显得非常有意义。本实验以重组毕赤酵母 GS115-Ch-Glu为实验对象,以 HCN 脱除率为主要指标,考察了接种量、温度、pH 值、水分、发酵时间等因素对毕赤酵母发酵木薯脱氰的影响,在单因素实验基础上对木薯发酵脱毒进行正交试验,最后确定了最佳发酵脱毒工艺条件为：接种量2.0%、温度30℃、pH6.0、水分50%及发酵时间54 h。在此最佳条件下,HCN脱除率达95.0%以上,是目前已知微生物法木薯脱毒的最高 HCN脱除率。     

谷胱甘肽生产菌重组巴斯德毕赤氏酵母的构建

目的：构建一株新型的产谷胱甘肽的重组巴斯德毕赤氏酵母，并研究该重组菌合成谷胱甘肽的能力；方法：利用PCR技术克隆来源于酿酒酵母的1-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶编码基因GSHI和谷胱甘肽合成酶的基因GSH2，串联插入表达载体pGAPZA，转化Pichia pastoris GS115，在Zeocin平板上挑选阳性转化子，并对阳性转化重组菌进行摇瓶培养筛选。结果：得到一株GSH的产量高达162．2mg／L重组菌，说明串联表达酿酒酵母GSH1和GSH2基因，重组甲醇酵母生产谷胱甘肽可以达到较高的水平。     

植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵条件的优化

对植酸酶毕赤酵母基因工程菌的营养条件和发酵条件进行研究.结果表明,其最佳培养基配方为(g/100 mL):葡萄糖5.00,玉米浆3.00,KCl 0.05,MnSO4·7H2O 0.03,FeSO4·7H2O 0.03,MgSO4·7H2O 0.07,KH2PO4 0.02;其最佳培养条件为:发酵初始pH 6.0,发酵温度31℃,用250 mL三角瓶,装液量为40 mL,菌体的接种量为10%(v:v),发酵周期60 h.在最佳发酵条件下,植酸酶活力提高3.57倍,高达5 462 u/mL.     

不同补料发酵方式对重组毕赤酵母高密度培养的影响

目的:研究5L发酵罐中葡萄糖补料方式对重组毕赤酵母高密度培养的影响,为大规模工业化生产奠定基础。方法:葡萄糖分批发酵阶段结束以后,以不同的流加策略流加补料培养基。结果:分批发酵初始葡萄糖最佳浓度为10g/L;采用间歇补料和恒速流加补料方式培养毕赤酵母,发酵结束后菌体细胞干重分别为33.2g/L和41.5g/L,而采用指数流加补料方式,发酵前期和发酵后期控制比生长速率分别为0.20h-1和0.15h-1,发酵结束后菌体细胞干重可达53.4g/L。结论:采用分阶段控制比生长速率的发酵策略,发酵结束后菌体细胞干重远远大于间歇补料和恒速流加补料发酵策略。      

毕赤酵母16B2菌株表达牛肉风味肽发酵条件的优化

牛肉风味强化肽（BMP）最初是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到,其一级结构为：Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-leu-Ala。BMP与食盐、MSG有较好的协同呈味的作用,并且具有很好的热稳定性,适合于食品工业生产中的热处理要求。因此,BMP有望代替MSG成为新一代风味强化剂。文章研究了由毕赤酵母胞外表达多拷贝牛肉风味肽的摇瓶发酵条件。确定最佳表达条件为：Yeast Nitrogen Base（YNB）的初始浓度为1%,诱导期pH为5.5,每24h添加1%的甲醇,诱导时间96h,多拷贝BMP的产量可达到约0.162g/L。     

玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达

以粉红黏帚霉菌株总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆得到玉米赤霉烯酮降解酶基因cD-NA序列,插入pPIC9K载体后,转化毕赤酵母。经MD板筛选,得到His+型重组子,进行甲醇诱导表达,并进行了降解玉米赤霉烯酮能力测定。克隆得到的cDNA序列全长795 bp,连续编码编码264个氨基酸;阳性克隆子在甲醇诱导培养3~5 d后,HPLC检测证实,经表达后的酶液能完全降解液体中玉米赤霉烯酮(ZEN)。     

Biocontrol of Postharvest Decay on Cherry Tomatoes by Recombinant Strain GS115/CEC and Its Possible Mechanism

Due to cecropin A’s effective antifungal effects against Alternaria alternata (A. alternata), recombinant Pichia pastoris expressing cecropin A could control incidence of the black rot in cherry tomatoes caused by A. alternata, when compared with fruits inoculated with sterile water or plasmid without the gene insertion. Observations using a scanning electron microscope and a transmission electron microscope showed that when treated with the recombinant yeast, obvious changes in the morphology and inner structure of the A. alternata were induced leading to some cell abnormality and lysing. In order to further clarify the molecular mechanism of action, the binding properties exerted by GS115/CEC on DNA and RNA of A. alternata fungal cells were examined. The results showed that DNA and RNA of the A. alternata fungal cells were degraded by the recombinant yeast GS115/CEC. Furthermore, the recombinant strain GS115/CEC could induce the expression of the pathogenesis-related protein in order to decrease postharvest decay in cherry tomatoes.