L-缬氨酸的应用和育种研究进展

L-缬氨酸在医药、食品及饲料领域中有着广泛的用途.国内大多数菌株的产酸水平不高,选育新的高产菌种显得尤为必要.本文综述了L-缬氨酸的应用方向以及根据L-缬氨酸的生物合成途径及其代谢调节机制,利用代谢调控理论,重点阐述了L-缬氨酸生产菌的育种思路及目前国内外L-缬氨酸育种的最新进展,为缬氨酸发酵生产提供理论指导.     

L-缬氨酸代谢工程研究进展

L-缬氨酸属于支链氨基酸,是人体八种必需氨基酸之一,广泛用于食品、医药、饲料、化妆品等领域.由于其含有特殊的生理功能,市场需求较大,使得L-缬氨酸的生产备受关注.代谢工程有着理性思维的设计,在氨基酸生产中得到广泛应用.主要阐述了L-缬氨酸生物合成途径中的关键酶及其代谢调控,综述了L-缬氨酸合成的代谢工程研究现状,并对利用代谢工程原理进行L-缬氨酸生产菌的理性设计提出展望.     

基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸

L-缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，随着市场对其需求量的不断提升，进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中，使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌VHL-1作为出发菌株，通过对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了L-缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先，通过敲除ldh(编码乳酸脱氢酶)、poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pyc(编码丙酮酸羧化酶)基因以及弱化alaT(编码丙氨酸转氨酶)基因表达来实现丙酮酸的富集。其次，通过强启动子P_tuf替换ilvBNC操纵子原始启动子并增加ilvBN(编码乙酰羟酸合酶)基因拷贝数来增强丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳代谢流。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调节蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株VHL-9在5 L生物反应器中进行补料分批培养，L-缬氨酸产量可到达(82.5±5.6) g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。     

谷氨酸棒杆菌ATCC 14067中L-精氨酸合成途径关键酶的过表达对L-精氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中与精氨酸合成相关的酶主要是由2个操纵子基因簇argCJBDFR和argGH编码合成。此外,在L-精氨酸合成途径的前体物谷氨酸和氨甲酰磷酸的合成中,由gdh、icd、gltA、carAB 4个基因分别编码的谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合酶、氨甲酰磷酸合成酶是谷氨酸和氨甲酰磷酸合成的关键酶。研究以解除了L-精氨酸的别构抑制作用的谷氨酸棒杆菌为出发菌株,利用3种不同抗性的表达质粒分别对这些关键酶的编码基因进行串联共表达。在最终得到的13个菌株中,L-精氨酸产量最高的菌株是出发菌株L-精氨酸产量的6.23倍,这表明串联过表达菌株L-精氨酸合成途径中,不同节点关键酶的编码基因可以更有效地提高菌株中L-精氨酸的产量,为进一步改造L-精氨酸的合成途径、优化L-精氨酸的产量奠定了基础。     

一株黄色短杆菌基因工程菌株的构建及其L- 缬氨酸积累

从谷氨酸棒杆菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032 中克隆出L- 缬氨酸合成途径上的限速酶--乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN。对ilvBN 进行定点突变,获得其抗反馈抑制突变型ilvBNr。以大肠杆菌- 黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-10 为基础,构建重组质粒pDXW-10-ilvBNr,并转化野生型黄色短杆菌B. flavum ATCC14067,获得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L 罐发酵实验结果显示：在野生型菌株发酵液中检测不到L- 缬氨酸积累,而工程菌株发酵液中L- 缬氨酸积累达5.0g/L。     

基因敲除降低L-缬氨酸发酵中亮氨酸和异亮氨酸含量的研究

黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)是L-缬氨酸生产的重要菌株,但缬氨酸发酵中常出现亮氨酸、异亮氨酸含量超标的问题.本研究敲除编码黄色短杆菌亮氨酸和异亮氨酸合成的关键基因,自主构建得到了工程菌株MH-1000-△ilvA、MH-1000-△leuA和MH-1000-△ilvA△leuA.对这些工程菌株进行摇瓶发酵和50 L罐发酵,结果表明,工程菌株有效地降低了L-缬氨酸发酵液中L-亮氨酸和L-异亮氨酸的含量,对于缬氨酸的高纯度生产具有一定的实际意义.     

全局调控因子Lrp的表达强化谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸

作者研究发现全局调控因子Lrp的表达能促进谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸,但对菌体生长有一定影响。RT-PCR分析发现:Lrp的表达能提高L-缬氨酸合成相关基因ilv A、ilv BN、ilv C、ilv D及转运相关基因brn FE的转录水平,这也许是L-缬氨酸产量提高的原因。实验还发现:表达含有点突变(Arg39Trp)的Lrp可以进一步提高谷氨酸棒状杆菌L-缬氨酸的产量,而且对菌体生长的影响也减小;这种效果在lrp-brn F间隔区域存在突变的L-缬氨酸生产菌VWB-1中更加明显。在VWB-1中共表达lrp1和brn FE基因,5 L罐发酵L-缬氨酸产量达到42.1 g/L,比对照提高了48.9%。     

糖蜜对重组谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062 33a△SSA-PS能够利用蔗糖直接发酵产L-丝氨酸。本文比较了不同的糖蜜预处理方法及其添加量对该重组菌的生长及产L-丝氨酸的影响,并进一步分析了糖蜜对丝氨酸合成相关途径中关键酶基因转录水平的影响。结果表明,糖蜜替代蔗糖作为唯一碳源时对产物合成并不利,但在蔗糖培养基中添加少量硫酸预处理的糖蜜有利于该菌的生长和产物积累。当其添加量为总糖量0.24%时,菌株生长最好,OD562可达76.37,L-丝氨酸产量为32.76 g/L,比未添加糖蜜的对照组分别提高了23.82%和29.44%。qRT-PCR结果表明,添加低质量分数糖蜜可显著提高EMP途径中关键酶基因的转录水平,这可能是促进产物积累的主要原因之一。     

不同葡萄糖转运途径相关基因的过表达对菌株葡萄糖代谢及产物合成的影响

磷酸烯醇式丙酮酸-葡萄糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate-dependent glucose phosphotransferase system,PTS~(Glc))和不依赖于PTS~(Glc)系统葡萄糖转运系统在葡萄糖转运和磷酸化过程中起重要作用。该文通过在葡萄糖代谢缓慢的L-赖氨酸产生菌Corynebacterium glutamicum(C.glutamicum)ZL-8中过表达肌醇透性酶基因(iol T1)、葡萄糖激酶基因(ppgk)和EIIGlc基因(pts G),研究葡萄糖转运途径相关基因对葡萄糖代谢速率、L-赖氨酸及副产物合成的影响。与出发菌株C.glutamicum ZL-8相比,重组菌C.glutamicum ZL-8/p ECXK-99E-ppgkiol T1(葡萄糖激酶酶活力提高了768%)和C.glutamicum ZL-8/p DXW-8-pts G(PTS~(Glc)系统酶活力提高了62.7%)葡萄糖消耗速率分别提高了16.7%和27.3%,L-赖氨酸产量分别提高了24.7%和16.4%。此外,有机酸和氨基酸分析结果表明,过表达不同葡萄糖转运途径基因对有机酸(丙酮酸、乳酸和乙酸)和副产物氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸)具有不同的影响。     

产多不饱和脂肪酸微生物的研究

概述了微生物油脂的研究发展过程,列举了多不饱和脂肪酸(PUFAs)的生理功能、产PUFAs的菌株及其脂肪酸组成的特点。同时,介绍了多不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶———脂肪酸脱饱和酶的基因研究情况,以及利用诱变育种技术、抗性筛选法、基因工程筛选等方法选育高产菌株的发展状况。     

氯化胆碱对L-缬氨酸发酵的影响

为探究氯化胆碱在微生物菌体培养方面的作用,采用微生物发酵法生产L-缬氨酸,以谷氨酸棒状杆菌XV0505(Leu~-+Ile~-+2-TA~r+α-AB~r+SG~r)为供试菌株,探究了其在不同氯化胆碱添加量以及在底物添加与联合随糖流加2种添加方式下生长、耗糖、产酸的情况。结果表明,发酵过程中氯化胆碱的添加方式为底物添加联合随糖流加,底物中氯化胆碱最适添加浓度为0. 5 g/L。此方式下,发酵周期内产酸量增加了18 g/L,较未添加氯化胆碱批次提升了26. 4%。氯化胆碱的外源添加能够有效增强菌体的活力,加快菌体生长,提高菌体产酸速率,为L-缬氨酸的生产提供了参考。     

纸层析法测定缬氨酸含量的改良

改进了缬氨酸含量的测定方法。探讨了茚三酮与缬氨酸完全反应的质量分数范围;将传统的静置洗脱更改为匀速摇床洗脱,使洗脱更完全;在此基础上,详细研究了操作过程中的相关参数,使结果更精确。结果表明,该方法有很高的准确度和精密度,操作简便,成本低,可以广泛应用于茚三酮反应测定氨基酸。     

L-缬氨酸高产菌XQ-8补料分批发酵的研究

在分批发酵优化条件基础上,通过对补料分批发酵方式发酵过程的各种参数,包括产酸率、转化率和发酵周期等进行了研究,确定了L-缬氨酸高产菌XQ-8补料分批发酵的最优条件。在最优补料分批发酵条件下发酵72h左右,L-缬氨酸产量达72g/L,糖酸转化率达38%以上,其结果明显优于分批培养。     

黄色短杆菌ilvBN和ilvC基因定点突变对L-缬氨酸发酵的影响

以黄色短杆菌MH-1000为出发菌株,使用PCR技术克隆ilvBN与ilvC基因,对ilvBN进行定点突变,获得解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶反馈抑制突变型基因ilvBN′.对基因ilvC进行点突变,获得乙酰羟酸变位酶突变基因ilvC′.通过重叠延伸PCR方法,将基因片段ilvBN′和ilvC′拼接为ilvBN′C′,进而连接至穿梭载体pXMJ19获得重组质粒pXMJ19-ilvBN′C′.该重组质粒转化至出发菌株获得工程菌株MH-1032.50L分批补料发酵结果显示:MH-1000发酵72hL-缬氨酸质量浓度为35.2g/L,MH-1032发酵72 h L-缬氨酸质量浓度为38.4 g/L,增长9.1%,糖酸转化率从21.7%提高到25.8%.     

有机氮源对谷氨酸棒杆菌发酵L-缬氨酸的影响

以L-缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌XV0505为供试菌株,研究有机氮源对L-缬氨酸发酵的影响,确定了玉米浆代替豆饼水解液作为有机氮源的发酵工艺,降低了发酵成本;考察不同玉米浆浓度对谷氨酸棒杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸过程中生物量、耗糖速率、L-缬氨酸产量、副产物积累及氨消耗等方面影响,确定了玉米浆的适宜添加浓度;考察了玉米浆与生物素不同配比对L-缬氨酸分批发酵过程的影响,确定了最适生物素添加浓度。与原工艺相比,新工艺的菌体生物量及产酸提高了13.2%和18.5%。     

基于近红外光谱结合代谢流分析的L-缬氨酸发酵过程监控

L-缬氨酸作为必需氨基酸之一,在许多发酵类食品配料方面有重要应用。及时监控其发酵过程,有利于L-缬氨酸产品品质的提升。本文建立了一种发酵类的食品配料生产过程监控新方法。该方法通过对发酵原料和产物进行分析,建立主要原料及产物的近红外模型,结合代谢流模型,能够快速分析不同发酵条件下细胞内部代谢流分布及变化,实时监测发酵过程各项参数。该方法能够实现同时对多组分快速、准确的检测,从而弥补了传统检测方法的缺点和不足;能够快速分析获得发酵过程细胞内部代谢流分布,从而帮助控制发酵过程条件,实时监测发酵过程参数,为发酵过程自动化控制提供理论基础,为发酵类食品配料生产过程监控提供方法。