鳗弧菌灭活疫苗对海水养殖大菱鲆的免疫预防研究

福尔马林灭活的鳗弧菌疫苗分别以浸泡、注射接种的方式对海水养殖大菱鲆鱼苗进行免疫 ,定期检测血清中特异性抗体。 4周后用鳗弧菌悬液 (3.7× 1 0 8cfu/ml) 0 .2ml腹腔注射感染免疫鱼。结果表明 ,灭活鳗弧菌疫苗用 2种方式免疫后都能刺激大菱鲜产生特异性免疫反应。其中注射免疫组在 1周后即可产生特异抗体 ,在 6周内一直呈上升趋势 ,最高达 1 2 2 8.8,免疫 4周后人工感染后的免疫保护力为 91 .70 %。浸泡免疫组在 3周后才产生抗体凝集价 ,凝集抗体效价最高 36 ,免疫保护力为 33.30 %。     

鳗弧菌油乳化二价口服疫苗免疫养殖大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究

以鳗弧菌M3和SMP1为细菌抗原制备了油乳化二价疫苗,用饵料包埋后连续7天口服免疫大菱鲆鱼,评价鱼的免疫应答和疫苗的保护效果.结果显示,乳化疫苗在鱼后肠刺激产生的溶菌酶和抗蛋白酶活性以及抗体水平均高于未乳化疫苗(P＜0.05);并且在乳化疫苗免疫的鱼血清检测到明显升高的M3抗体效价(P＜0.05).原位杂交结果显示,乳化疫苗免疫鱼的后肠IgM的产生水平高于未乳化疫苗免疫鱼.攻毒实验显示,乳化疫苗免疫的鱼对M3和SMP1的感染分别获得100%和50%的免疫保护率,而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9%和0%.结果表明,鳗弧菌油乳化二价口服疫苗能引起大菱鲆后肠的非特异性和特异性免疫应答并有效地抵抗鳗弧菌的感染,适合用作水产口服鱼用疫苗.     

大菱鲆出血症病原菌的分离和鉴定

从患病大菱鲆体内分离到一株病原菌SMP1,经人工感染试验计算出SMP1的半致死量LD50 =1.94× 10 6 。药敏实验表明氟哌酸、丙氟哌酸、复合磺胺、氯霉素、四环素对SMP1有较强的抑制作用。BIOLOG细菌鉴定系统不能对SMP1鉴定。综合形态观察、生理生化特征、16SrDNA、溶血素基因保守区分析等实验结果 ,可将SMP1鉴定为鳗弧菌。     

牙鲆与大菱鲆病原迟钝爱德华氏菌生物学特性及系统发育学分析

对从7起牙鲆（Bastard halibut,Paralichthys olivaeeus L．）、3起大菱鲆（Turbot,Scophdudmus maximus L．）病害的病（死）鱼中分离到的相应病原菌较系统地进行了形态特征、理化特性等表观分类学指征的鉴定及代表菌株DNA中G＋Cmol％的测定。同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树。结果表明,分离鉴定的148株菌均为爱德华氏菌属（Edwardsiella Ewing and McWhorter 1965）的迟钝爱德华氏菌（E．tarda）,其中128株为迟钝爱德华氏菌野生型（E．tarda wild type）菌株,20株暂定为迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株。代表菌株（HC010907—1及HC010830-1）的16SrRNA基因序列,与GenBank数据库中的迟钝爱德华氏菌的同源性均在99％。     

致病性鳗弧菌金属蛋白酶基因克隆及序列分析

从我国山东沿海发病的鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到一株致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）W-1，该菌的胞外蛋白酶活性为4226u/ml，部分纯化的胞外蛋白酶对海水养殖大菱鲆鱼有一定的毒性。应用PCR扩增，从鳗弧菌W-1染色体DNA扩增出一条长约1.925kb的特异性PCR产物，DNA序列分析表明：克隆的片段含有完整的金属蛋白酶基因阅读框，编码611个氨基酸残基的蛋白质，该金属蛋白酶基因与一株致病性鳗弧菌蛋白酶基因的核苷酸及氨基酸序列同源性为100%，而与解蛋白弧菌（V.proteolyticus)、创作弧菌（V.vulnificus）、霍乱弧菌（V.cholerae)、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的氨基酸序列同源性分别为73%、70%、69%、53%、51%。     

鳗弧菌金属蛋白酶单克隆抗体的制备及鉴定

鳗弧菌M3胞外产物经纯化得到分子量为36.5kDa的金属蛋白酶，浓缩后作为抗原免疫BALB/C小鼠，经细胞融合及筛选。得到三株稳定分泌抗金属蛋白酶的杂交瘤细胞株。分别命名为P2B1，P4A3和P4B1。亚型鉴定结果表明，三株细胞株产生的单抗均为IgG3型。蛋白质印迹（Wes tern Blot)分析显示，所得到的单抗只与分子量为36.5kDa的金属蛋白酶反应，具有较高特异性。三株单抗均能有效抑制蛋白酶活性。     

鳗弧菌溶血素基因的克隆及突变株的构建

PCR扩增出鳗弧菌M3溶血素基因的保守区序列,根据保守区序列设计引物,利用反向PCR和巢式PCR扩增出溶血素基因的部分序列,结合构建的鳗弧菌M3的基因组文库,克隆出溶血素基因的全长序列。根据基因推测的氨基酸编码序列与已发表的血清型为A的鳗弧菌PT84057有86％的相似性。用自杀质粒对鳗弧菌M3染色体上的溶血素基因进行了插入突变,将突变株对金鱼进行肌肉注射,结果发现,突变株的毒力没有发生显著的变化,证明所克隆的溶血素基因对鳗弧菌M3的毒力没有直接的贡献。     

从鳗弧菌M3 Fosmid文库筛选aroA基因

为克隆鳗弧菌aroA基因 (它在细菌中编码合成芳香族氨基酸的关键酶--5-烯醇氏丙酮酰莽草酸3-磷酸(EPSP)合成酶),在实验室中构建了鳗弧菌M3大分子量基因组Fosmid文库,并通过克隆测序获得了部分序列,以此为基础,通过延伸测序获得了ar oA基因序列全长. 该基因全长1281bp,编码427个氨基酸,包含一个11个氨基酸残基的信号肽;编码区GC平均含量为46.8%,推测分子量为46177 Da.相似性分析表明,鳗弧菌的aroA核苷酸和氨基酸序列与其他弧菌的相似性最高,分别在73%～75%和78%～82%;进化树结果也表明鳗弧菌ar oA与其他弧菌的亲缘关系最近.aroA基因的克隆为构建鳗弧菌弱毒疫苗奠定了基础.     

鳗弧菌胞外产物中致病因子的分离纯化及性质研究

鳗弧菌致病株M3的胞外产物经超滤、Sephadex G100凝胶层析、DEAE－cellulose离子交换层析和HPLC凝胶色谱层析纯化后，得到一个纯化的毒性蛋白酶，其对金鱼的半数致死量为1.2微克蛋白／克体重。该蛋白酶的分子量为36.5kDa，等电点为5.1；与底物Azocasin作用的最适pH为8.0，最适作用温度55℃,85℃作用30min后酶被灭活。该酶活性可被EDTA、EGTA及1，10－菲咯啉抑制，表明它是金属蛋白酶。N端部分氨基酸序列经测定为AGATGTGPGGAGLTG。     

鳗弧菌pEIB1质粒缺失株MVAV6201的筛选和三价铁源供给的优化

以鳗弧菌Vibrio anguiUarum MVM425(01型)为出发菌株,通过变温培养诱变筛选得到pEIB1质粒缺失株MVAV6201。通过与野生株MVM425的摇瓶培养对比发现,Fe^3 营养的摄取是质粒缺失株MVAV6201生长的瓶颈。MVAV6201对Fe^3 的吸收有赖于外界Fe^3 营养的供给形式。柠檬酸铁铵能有效增强MVAV6201对三价铁营养的吸收,促进菌体细胞的生长。柠檬酸铁铵饱和浓度为0．4mmol／L。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)一种CXC趋化因子的克隆及其表达特征

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到一种CXC趋化因子。它的全长cDNA含有一个81bp的5’UTR,一个414bp的开放阅读框和一个449bp的3’UTR。开放阅读框编码了137个氨基酸残基。经过PCR扩增发现,该CXC趋化因子基因内含有4个外显子和3个内含子。RT-PCR分析表明,大菱鲆CXC趋化因子在正常脾脏和头肾中表达强烈;在胚胎的不同发育时期,大菱鲆CXC趋化因子从体节期开始才有微弱的表达。大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染后6h也有强烈的表达。这些结果表明该CXC趋化因子在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

大菱鲆MHCⅡB基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,得到了1297bp的大菱鲆MHCⅡB全长cDNA片段.该序列包括741bp的开放阅读框(ORF),35bp的5'末端非编码区(UTR)以及521bp的3'末端非编码区.序列比对结果表明,大菱鲆MHCⅡB与牙鲆MHCⅡB的同源性高达71.5%,与真鲷、鲈鱼和丽鱼的同源性分别为67.1%,70.7%和68.4%,与人、鼠和鲨鱼MHCⅡB的同源性仅分别为24.1%,25.1%和13.2%.组织表达研究显示,MHCⅡB基因在正常大菱鲆组织中均表达,但表达量在各个组织中不同,其中较强的表达于鳃、脾、头肾、小肠中,中等程度表达于血、心脏和皮肤,在肝、性腺和肌肉中表达最弱.     

大菱鲆（Scophthalmus maximus L）养殖现状与可持续发展

大菱鲆（Scophthalmus maximus L）的良种优势地位已在我国确立，工厂化养殖的初级模式已经形成并获得普遍推广；规模化养殖和成鱼市场的不断扩大，将我国推进到世界大菱鲆养殖和消费大国行列；“大菱鲆效应”对我国海水工厂化养殖发展和沿海“三农”经济的拉动作用很大，也为我国海水工业化养殖奠定了理论和实践基础；当前由大菱鲆养殖产业的迅速发展而带来的机遇和挑战，正推动着我国海水工厂化养鱼朝良种化、规范化、国产化全封闭式的高级阶段攀登。     

大菱鲆免疫球蛋白M(IgM)单克隆抗体的制备与特性鉴定

应用细胞工程技术研制大菱鲆免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)的单克隆抗体并分析其免疫学特性。小鼠骨髓瘤细胞NS0与经IgM免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合,经过反复有限稀释法克隆,筛选获得4株抗大菱鲆IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为B1D1、D5C2、E1B2和F4A1。经小鼠腹水扩大生产后,单抗效价为1∶1.024×106检测灵敏度为32 ng/mL。Western blot分析表明,获得的单抗与IgM重链区特异性结合。交叉结果显示,单抗与大菱鲆血清呈强阳性反应,与褐牙鲆、红鳍东方鲀、许氏平鲉、六线鱼、鲈鱼均呈微弱阳性反应,而与半滑舌鳎、鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鳙鱼的血清无交叉反应。本研究制备的大菱鲆IgM单克隆抗体效价高、灵敏度高、特异性强,适合用于大菱鲆免疫学相关研究和生产实际应用。     

大菱鲆疾病早期快速检测方法——胶体金免疫层析试纸的研制与建立

使用成分单一的牛血清白蛋白(BSA)为模拟病原,以胶体金标记兔抗血清(即大菱鲆免疫球蛋白多抗)作为检测示踪物,并分别将BSA和葡萄球菌A蛋白印记到硝酸纤维素膜上制成检测线和对照线,通过一系列工艺创制与组装配套,首次成功制备了一套完整的大菱鲆抗体快速检测试纸。采用大菱鲆抗BSA血清作为阳性样本,以健康大菱鲆血清作为阴性样本,用以检验试纸的性能,并与酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测结果相比较。结果表明:本试纸检测抗体的特异性与敏感性均很高,与ELISA方法相当,而且使用方便,不需专业技能和额外的试剂与辅助仪器设备,5 min内即可用裸眼获得观察结果,很适合于基层生产操作及户外调研使用。以该实验为基础建立起来的抗体检测试纸,亦可推广应用于其他病害抗体的检测,可为鱼类疾病早期发生提供简易、快捷和操作性强的诊断方法。     

应用间接ELISA技术快速检测花鲈病原菌-鳗弧菌

以花鲈（Lateolabrax japonicus)弧菌病的病原菌－鳗弧菌（Vibrio auguillarum)W-1为抗原,制备兔抗血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清（HRP－IgG)为酶标二抗,建立了检测鳗弧菌的间接ELISA快速检测法。结果表明,应用间接ELISA技术检测鳗弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为10^5个／ml,即10^4个／孔。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。对46份人工感染后的花鲈组织样品,包括肌肉、鳃、肠、肝、肾等组织的检测表明,阳性检测率为76．1％。     

P(VDF-HFP)分子结构与Li+传输关系的研究

采用半经验量子化学PM3和ab initio分子轨道(MO)计算方法对聚偏氟乙烯-六氟丙烯[P(VDF-HFP)]共聚物的4种可能结构的分子构型进行了优化及频率计算,平面顺式是最稳定的构型,平面交叉反式次之.Mulliken电荷及轨道分析显示,碳链及其氟原子在Li 的传输过程中应起较大的作用,而氟甲基在Li 的传输过程中基本不起作用.