耐热黑曲霉3.316产内切葡聚糖苷酶培养条件优化及酶学性质研究

以内切葡聚糖苷酶的酶活力为指标,采用单因素结合和响应面法对黑曲霉产内切葡聚糖苷酶的培养基组分进行优化,并研究内切葡聚糖苷酶酶学性质。结果表明:最佳培养基组分为小麦秸秆16.29 g/500 mL,硫酸铵2.24 g/500 mL,微晶纤维素+麦芽糖2.16 g/500 mL,在该条件下内切葡聚糖苷酶酶活力4.257 U/mL,优化后的酶活力提高了86%。内切葡聚糖苷酶最适温度是60℃,热稳定性在50℃较高;内切葡聚糖苷酶最适pH值是3,稳定性在5时较高。动力学模型表明以羧甲基纤维素钠为底物的内切葡聚糖苷酶Km=0.0211 mol/L,Vm=0.0036 mmol/min。内切葡聚糖苷酶能够在高温及酸性环境中发挥作用,参与高效降解高温酸性环境中的纤维素,提高其生产率,具有应用高温大曲发酵酒生产的潜力。     

黑曲霉DB056发酵α-鼠李糖苷酶和柚苷酶培养基的优化研究

目的:优化黑曲霉DB056产α-鼠李糖苷酶和柚苷酶的培养基,提高这两种醇的产量.方法:以α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力为指标,研究碳源、氯源和乳化剂Triton X-100对α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力的影响,优化黑曲霉DB056摇瓶发酵α-鼠李糖苷酶和柚苷酶的培养基.结果:碳氮源的种类与浓度,乳化剂Triton X-100的浓度对黑曲霉DB056产α-鼠李糖苷酶和柚苷酶有重要影响;黑曲霉DB056产酶的优化培养基是:柚皮苷3.5 g/L,玉米浆4g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,KH2PO41.0g/L,KCl 0.5 g/L,无水CaCl20.1 g/L,乳化剂Triton X-1001.0%.此时α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力分别为994U/mL和276U/mL,分别比发酵初始培养基提高了42.3%和147.8%.结论:通过培养基优化,大幅度提高了黑曲霉DB056液态深层发酵α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力.     

β-葡聚糖酶产酶培养基的优化

通过对黑曲霉(QYW-01A06)产β-葡聚糖酶培养基的研究,得出其最佳培养基配方为(/100mL):大麦粉4.0g,玉米浆1.0g,(NH4)2SO40.3g,NaNO30.2g,MgSO40.02g,FeSO4·7H2O0.01g,CaCO30.5g;在最佳培养基条件下进行摇瓶培养(80mL培养基/500mL三角瓶),每毫升发酵液酶活力达5252u,酶活力是初始培养基的2.6倍。     

淀粉液化芽孢杆菌5582产β-葡聚糖酶的发酵条件和酶学性质研究

报道了淀粉液化芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefacien）BS5582菌株产β-葡聚糖酶和蛋白酶的液体发酵条件优化和酶学特性的研究结果。摇瓶水平下产β-葡聚糖酶的最佳培养基（g/L）为大麦粉40,玉米粉30,豆饼粉30,Na2HPO4·12H2O6,（NH4）2SO44,MgSO·47H2O1,CaCl20.8;产酶最佳起始pH7.0,装液量25mL/250mL。种子于37℃培养10h后,接种量8%,在37℃下发酵51.75h后β-葡聚糖酶酶活最高达到182.52U/mL,蛋白酶酶活达8062U/mL。β-葡聚糖酶的最佳反应pH6.5,最佳反应温度50℃。10mmol/L的Ca2+、Na+、NH4+、K+、Mg2+对β-葡聚糖酶活性有一定的激活作用;而相同浓度的Cu2+、Fe2+则表现出较强的抑制作用。      

黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱层析,得到5个洗脱峰,其中峰2含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰3含内切酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶,酶系较全面;峰5含内切酶和外切酶;峰1和峰4没有纤维素酶活性。采用DEAF FF弱阴离子交换柱层析对峰2进行分离纯化,从中分离纯化得到1种内切葡聚糖苷酶组分,经SDS-PAGE电泳分析,其分子量为61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC酶活在pH4.0～6.0的条件下,可保持初始酶活的70%～80%,最适酶反应pH值为5.0;温度在30～50℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为50℃,若超过60℃,酶活迅速下降。     

淀粉液化芽孢杆菌产β-葡聚糖酶培养基优化以及酶稳定剂的研究

采用正交试验方法,进行了淀粉液化芽孢杆菌发酵产β-葡聚糖酶培养基的优化。结果表明,采用玉米粉30g/L,大麦粉40g/L,豆饼粉30g/L,Na2HPO4.12H2O 6g/L,(NH4)2SO4 4g/L,CaCl2 0.8g/L,MgSO4.7H2O1g/L组成的培养基发酵,β-葡聚糖酶活力达到128.55U/mL,比优化前提高了22.48%。在β-葡聚糖酶溶液中添加大分子亲水型多糖黄原胶、动物蛋白明胶、甘油、氯化钠可明显提高β-葡聚糖酶的热稳定性。将添加甘油120g/L、黄原胶5g/L复合稳定剂的葡聚糖酶溶液60℃处理2h,酶液的残余酶活比未经处理的酶活提高了55.3%。     

黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100 凝胶柱层析,得到 5 个洗脱峰,其中峰 2 含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰 3 含内切酶、外切酶及 ?-葡萄糖苷酶,酶系较全;峰 5 含内切酶和外切酶;峰 1 和峰 4 没有纤维素酶活性。采用 DEAF FF 弱阴离子交换柱层析对峰 2 进行了分离纯化,从中分离纯化得到一种内切葡聚糖苷酶组分,经 SDS-PAGE 电泳分析,其分子量为 61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC 酶活在 pH4.0～6.0 的条件下,可保持初始酶活的 70 %～80 %,最适酶反应 pH 为 5.0;温度在 30～50 ℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为 50 ℃,若超过 60 ℃,酶活迅速下降。     

重组β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因在大肠杆菌中的共表达

β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖苷酶是纤维素酶的重要组分,多基因的共表达在各领域有重大的应用价值,本研究利用pET32a和pET30b两个载体的不同抗性的特性,在大肠杆菌中将β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因,实现了不相容性共表达,获得了产两种酶的工程菌,酶活力可达1196.8U/mL。比单一酶组分的酶活力高,酶学性质分析显示共表达酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度60℃,在pH5⁷范围内能保持较高活性,酶活可达最高酶活的80%以上,在30⁶0℃范围能有较高的温度稳定性,酶活维持在80%以上。这一结果将为工业应用的进一步研究提供理论基础。      

内切型菊粉酶酶学性质的研究

以食品与生物工程实验中心酶工程实验室保藏的黑曲霉菌种作为菌源,利用黑曲霉细胞深层发酵法生产内切型菊粉酶。通过测定发酵液酶活,从20株黑曲霉菌株中筛选得到产菊粉酶活力最高的编号为E133131的一株黑曲霉菌株,酶活为0.66U/mL。对黑曲霉E133131号菌株所产内切型菊粉酶进行了酶学性质的研究,得到以下结论:最适pH为4.5;最适温度为60℃;最佳底物浓度为4mmol/L;米氏常数(Km)为1.434mmol/L;Ca2+对内切型菊粉酶有激活作用,当加入浓度为1.5mmol/L的Ca2+时,使酶活从0.66U/mL提高到1.09U/mL;Mn2+、Cu2+和Mg2+对内切型菊粉酶有抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最大,使酶活从0.66U/mL降低到0.095U/mL;Na+、K+、Zn2+、Fe2+、Mg2+对内切型菊粉酶的酶活影响不大;pH在4.5~8.0范围内,温度在50~60℃之间,内切型菊粉酶的酶活力较稳定。     

黑曲霉(Aspergillue niger)产菊粉酶发酵条件的研究

以菊粉为唯一碳源,对样土进行产菊粉酶黑曲霉菌株的初筛,得到17株菌株.用跟踪测酶活的方法进行复筛,获得3株高产菊粉酶菌株,最高酶活达到25.41U·mL-1.然后探讨了不同碳源和氮源对黑曲霉产菊粉酶活力的影响,结果表明,最佳碳源为菊粉,氮源为酵母膏.通过正交实验,得到了优化的产菊粉酶黑曲霉液体发酵条件:菊粉用量为2%.pH5.0,50mL三角瓶中装培养基量为50mL,发酵温度为30℃.     

高产α-葡萄糖苷酶黑曲霉的微波选育及发酵条件优化

采用微波诱变技术对黑曲霉J2进行选育,得到1株α-葡萄糖苷酶活力较高的突变菌株ANY-4,酶活力达到305 U/mL,比出发菌株提高了38.6%,且稳定性良好。通过单因素和正交试验得到最适培养条件为:玉米淀粉80 g/L、玉米浆干粉40 g/L、初始pH 4.5、装液量50 mL/500 mL、接种量3%、培养温度36℃、摇床转速240 r/min、培养时间40 h。在最优培养条件下进行发酵,α-葡萄糖苷酶活力达到427 U/mL,比优化前提高了40%。     

里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的条件优化

为提高纤维素酶酶解秸秆产糖效果,以碱性双氧水处理过的玉米秸秆为发酵基质,进行里氏木霉与黑曲霉混合发酵的研究。通过单因素试验确定黑曲霉延迟接种时间、里氏木霉与黑曲霉接种比例 、发酵时间和固液比4个因素的最优水平。在此基础上,采用Box-Behnken响应面设计对混合发酵产酶条件进行优化,获得最佳产酶条件：黑曲霉延迟接种时间 36h,里氏木霉与黑曲霉接种比例 5:1、发酵时间7d、固液比2:50(m/V)、吐温-80体积分数0.4%、pH 5.0和装液量50mL/250mL。此时,滤纸酶力(FPA)可达1.224 IU/mL,β-葡萄糖苷酶活力(β-GA)可达0.315 IU/mL。采用高效液相色谱法,对最佳条件下的纤维素酶酶解秸秆的水解液进行检测。结果表明,两菌株混合发酵较单菌株发酵的纤维素酶系更加完整,且降解木质纤维素类原料产可发酵性糖的能力增强。     

高温混菌发酵生产果胶酶的研究

为了降低底物抑制效应,提高黑曲霉产果胶酶的能力,在黑曲霉发酵过程中引入酒精酵母,成功构建了黑曲霉GJ-2与酒精酵母J-1混菌发酵生产果胶酶的体系,确定了酒精酵母的最佳接入时间和最佳接入量分别为12h和5mL/50mL,并对其产酶条件进行响应面优化,实验中发现高温对产酶有促进作用,确定最佳产酶条件为:橙子皮29.3g/L,麸皮30.0g/L,硫酸铵11.8g/L,吐温-802.0g/L,发酵温度34.1℃,在此条件下果胶酶酶活为188.12U/mL,比黑曲霉单一体系发酵生产果胶酶提高了63.6%。     

响应面法优化黑曲霉SH312-26-19产果胶酶发酵条件

在单因素试验的基础上,运用响应面法优化黑曲霉SH312-26-19产果胶酶的发酵条件,并与市售果胶酶进行产甲醇含量的对比试验。结果表明,黑曲霉最适发酵条件为培养基中麸皮添加量11 g,发酵时间4 d,发酵温度30 ℃。在此优化条件下,该黑曲霉产果胶酶活力达到（2 518.69±19.34） U/mL。该果胶酶在酶促反应体系中甲醇的生成量分别比市售果胶酶1和市售果胶酶2低17.9%和12.8%,显著低于市售果胶酶（P＜0.05）。     

黑曲霉发酵花生壳提取水溶性膳食纤维

以花生壳为原料,应用黑曲霉固态发酵制备花生壳水溶性膳食纤维。通过对黑曲霉菌株特性及其培养基优化的研究,确定培养温度、菌龄、接种量、培养时间的最佳水平,响应面辅助法获得花生壳水溶性膳食纤维的最佳提取工艺条件为：以8g 花生壳为原料,水1.88mL/g 原料,(NH4)2SO4 1.88g/100mL、KH2PO4 1.88g/100mL和MgSO4 5.63g/100mL 的优化培养基,培养温度27℃、黑曲霉菌龄2.9d、接种量16mL、培养时间9.1d,黑曲霉发酵液水解花生壳酶解率可以达到11.03%,水溶性膳食纤维中已糖的聚合度为152.71%,综合评分为105.48。     

黑曲霉液体深层发酵产纤维二糖酶的研究

纤维二糖酶（cellobiase）是纤维素酶系中的重要组分之一,目前由里氏木霉（Trichoderma reesei）生产的纤维素酶制剂中纤维二糖酶的活力明显偏低,限制了纤维素的糖化效率。本文采用一个黑曲霉菌株（Aspergillus niger ZU-04）,在液态发酵条件下生产纤维二糖酶,对主要的发酵工艺参数进行了研究,结果表明,培养基中添加1.0%的麸皮对纤维二糖酶的形成有明显的促进作用;葡萄糖、玉米浆粉的适宜浓度分别为2.0%、0.3%;变温培养缩短了产酶周期,培养4d,酶活力达到最高,为6.23IU/mL。采用黑曲霉纤维二糖酶与里氏木霉纤维素酶协同水解酸预处理后的玉米芯,当纤维素酶用量为20IU/g底物时,纤维二糖酶活力和滤纸酶活力比例为0.43,2d酶解得率达到91.1%。     

黑曲霉耐酸性α-淀粉酶的固态发酵条件研究

研究了固态发酵条件对黑曲霉(Aspergillus niger)PZ301合成酸性α-淀粉酶的影响。结果表明,固态发酵最佳培养基组成:麸皮7.0g,葡萄糖0.07g,淀粉0.21g,(NH4)2SO40.07g,起始pH 4.2;最佳培养条件为培养温度35℃,料水比为1∶1,接种量3mL(孢子浓度为107个/mL)。在上述条件下培养72h,酶活力可达19.6IU/g干培养基。另外还测定了PZ301固态发酵中生物量的变化,PZ301菌株的生物量和耐酸性α-淀粉酶在72h时均达到最高,这表明耐酸性α-淀粉酶系同步合成型酶。     

葡萄糖酸钠酶法生产工艺研究

以市售的葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶为基础,探索出最佳的酶法生产葡萄糖酸钠的工艺条件为温度32 ℃、转速190 r/min、通风量1 600 m3/h、葡萄糖氧化酶添加量4 mL/g,过氧化氢酶添加量在3 mL/g。并从反应进程、最终残糖、过滤时间、脱色效果、结晶产品质量等方面对酶法及黑曲霉发酵法生产葡萄糖酸钠工艺进行分析比较,确定了酶法生产葡萄糖酸钠优于微生物发酵法生产葡萄糖酸钠。     

果胶酶生产及其在苹果汁澄清中的应用

对黑曲霉(Aspergillus niger)LLW-1菌株固态发酵生产酸性果胶酶的发酵培养基组成和发酵条件以及利用果胶酶澄清苹果汁的工艺条件进行了研究。固态发酵产酶条件为:250 mL三角瓶装10 g基料(豆饼∶麸皮=2.0 g∶8.0 g),(NH4)2SO420 g/kg,Tween-80 1.5 g/kg,玉米浆50 mL/kg,KH2PO43.0 g/kg,CaCl21.0 g/kg,MgSO4.7H2O 1.0 g/kg(均相对于基料),料水比1∶1.2,自然pH;31℃静置培养72 h,期间在为24 h翻曲1次,果胶酶活力达2 418 IU/g(干曲)。酸性果胶酶澄清苹果汁的工艺条件为:果汁自然pH值,果胶酶用量500IU/L(果汁),明胶添加量0.05 g/L(果汁),酶解温度和时间分别为45℃和1 h。