基于MALDI-TOF MS技术快速检测产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌

该研究探讨了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪快速鉴别产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的方法。通过对标准品进行分析,重新对特征峰进行定位并测定其灵敏度,并用正交试验分析不同培养条件下检验结果的差异,用优化后的培养条件对49株野生蜡样芽胞杆菌及3株标准菌株进行特异性检验。研究表明,MALDI-TOF MS可检测到产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌中呕吐毒素相应m/z值为1 175的[M+Na]+和m/z值为1 191的[M+K]+加合物特征峰,具有较高的灵敏度（0.01 μg/mL）,经极差分析显示,选用MYP培养基30 ℃培养12 h后的菌落能获得最稳定、响应值高（>104）的检验结果;方法应用验证表明,49株野生菌株中2株含ces基因的蜡样芽胞杆菌均检出,其余未含有ces基因的菌株均未检出。该研究建立的MALDI-TOF MS检测方法能直接快速准确检出产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌,该方法检测特异性强（100%）,灵敏度高（0.01 μg/mL）,对于食品安全事故快速精准分析研判有重要的意义。     

基于环介导等温扩增技术的产呕吐毒素 蜡样芽胞杆菌特异性检测

本研究旨在建立食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速检测方法.基于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌合成酶基因cesB靶基因,设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),建立环介导等温扩增技术(LAMP).然后采用2株产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌、19株蜡样芽胞杆菌和41株非蜡样芽胞杆菌验证了该LAMP具有很好的特异性.LAMP检测的灵敏...     

生食蔬菜模拟污染米饭样本中蜡样芽胞杆菌和呕吐毒素基因分布状况研究

目的 分析被生食蔬菜模拟污染的米饭样本中蜡样芽胞杆菌（Bc）和呕吐毒素基因（ces）的分布状况,为Bc食物中毒科学防控提供基础数据。方法 采集生食蔬菜样本50件,每件样本用0.85%生理盐水盥洗后污染“新煮熟米饭”,置于30 ℃、70% RH培养箱中放置24 h。对生食蔬菜和“污染米饭”进行Bc的定量计数、荧光PCR检测和数字PCR检测。对基于不同采集地点、不同蔬菜类型分组的生食蔬菜样本和及被其污染的“污染米饭”的各项检出率指标进行统计学分析。结果 生食蔬菜样本中Bc检出率为80.00%（40/50）,ces基因和Bac16s RNA基因检出率分别为0（0/50）和10.00%（5/50）;“污染米饭”样本Bc检出率为94.00%（47/50）,ces基因和Bac16s RNA基因检出率分别为14.00%（7/50）和90.00%（45/50）。采集自农贸市场和农户土地的2组生食蔬菜中Bc检出率差异有统计学意义（χ²=11.063,P=0.000 88校正）,被上述2组生食蔬菜类污染的“污染米饭”Bac16s RNA基因检出率和ces基因检出率差异均有统计学意义（χ²=3.926,P=0.047 5校正;χ²=5.444,P=0.019 6校正）。7件“污染米饭”基于荧光PCR检测ces基因阳性,Ct值介于24.12~37.73,数字PCR结果介于6.8 copes/μL~6.2×10⁶ copes/μL。结论 被生食蔬菜模拟污染的米饭样本可具有导致Bc食物中毒风险的病原学特征。     

2012—2014年江西省市售婴幼儿配方食品中蜡样芽胞杆菌调查及呕吐毒素基因分析

目的了解2012—2014年江西省市售婴幼儿配方食品中蜡样芽胞杆菌的污染情况并对呕吐毒素基因进行分析。方法在全省市县中选取13个采样点,包括超市、百货商场、便利店、农贸市场、网店、批发市场,随机抽取婴幼儿配方食品397份,对蜡样芽胞杆菌进行检测和鉴定,同时应用叠氮溴化丙锭内参多重PCR方法检测分离株的呕吐毒素基因。结果 397份食品中蜡样芽胞杆菌阳性率为13.10%(52/397),其中2013年阳性率最高。不同采样点的阳性率差异有统计学意义(P0.05),不同产地、不同流通环节和不同年龄段的阳性率差异无统计学意义(P0.05),52份阳性食品中检出呕吐型蜡样芽胞杆菌2份,呕吐毒素阳性率为3.85%。结论江西省市售婴幼儿配方食品中存在蜡样芽胞杆菌及呕吐型蜡样芽胞杆菌的污染,存在一定的安全隐患,相关监管部门应继续加强监管,预防食源性疾病的发生。     

应用多重实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌毒力基因

目的:建立一种快速、准确、简便的蜡样芽胞杆菌毒力基因检测方法,为蜡样芽胞杆菌更深入的研究提供依据和便利。方法:采用TaqMan探针法设计了三重hblA,hblC,hblD基因,三重nheA,nheB,nheC基因,三重ces,entFM,bceT基因的多重实时荧光PCR体系检测蜡样芽胞杆菌毒力基因。结果:多重体系对蜡样芽胞杆菌毒力基因的检测具有良好的特异性和灵敏性,其最低检出限为63 CFU/mL。结论:利用上述体系对蜡样芽胞杆菌的毒力基因进行检测能够省时省力,特异性、灵敏性良好,具有实际应用价值。     

2012～2016年云南省婴幼儿食品和即食食品中蜡样芽胞杆菌污染状况调查评估

目的 调查分析和评估云南省2012~2016年婴幼儿食品和即食食品中蜡样芽胞杆菌污染状况。方法 本研究的样品包括2012年到2016年采集自云南省16个地州的1014份婴幼儿食品和3361份即食食品。按照GB 4789.14-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》第一法平板计数法进行检验, 并用国际上现有的限量标准进行评估分析。结果 婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌的平均检出率分别为18.1%(2012)、5.5%(2013)、18.2%(2014)、2.5%(2016), 超标产品的比例分别为1.1%(2012)、1.9%(2013)、1.7%(2014)。即食食品的平均检出率分别为7.6%(2012)、1.3%(2013)、13.9%(2014)、6.5%(2015)、10.1%(2016)。结论 建议对婴幼儿食品中的蜡样芽胞杆菌以102 CFU/g为临界值进行污染评估、对普通即食食品针对儿童与成人分别以103~105 CFU/g和大于105 CFU/g 2个值作为临界值进行评估。     

淮安市218批婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌毒力基因检测和耐药性分析

目的 了解淮安市婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌污染现状及其对药物敏感、主要毒力基因携带情况。方法2022～2023年抽取淮安市七个县区的婴幼儿奶粉及婴幼儿辅助食品共218批,根据GB4789.14-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）进行检测,并进行药物敏感性试验,采用荧光定量PCR对检出的蜡样芽胞杆菌进行溶血性（hblC）基因、非溶血性基因（nheB）、呕吐毒素基因（ces）检测。结果 218批婴幼儿食品中蜡样芽胞杆菌检出39批次,检出率达17.89%。在23种药物敏感性试验中,蜡样芽胞杆菌对庆大霉素、阿米卡星、替考拉宁、万古霉素、氯霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、利福平、左氧氟沙星、莫西沙星、诺氟沙星敏感率100%,对环丙沙星、米诺环素、四环素、红霉素、克林霉素、莫匹罗星高浓度、复方新诺明、苯唑西林敏感率分别为97.44%、92.31%、89.74%、82.05%、38.46%、23.08%、20.51%、5.13%,对达托霉素非敏感,对头孢洛林、氨苄西林、青霉素全部耐药。溶血性hblC基因携带率高达100%,非溶血性基因nheB携带率为...     

成都市市售食品中蜡样芽胞杆菌污染状况与毒力基因分析

目的研究成都市市售食品中蜡样芽胞杆菌毒力基因携带及对抗生素的耐药情况。方法 2014—2016年,在成都市农贸市场和路边摊点共采集食品样品330份,按照GB 4789.14—2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》分离疑似菌株,应用管家基因和16S rDNA测序鉴定蜡样芽胞杆菌,并针对分离菌株携带的毒力基因及对抗生素的耐药性进行检测。结果 2014—2016年,蜡样芽胞杆菌总检出率为17.6%(58/330),不同类型食品蜡样芽胞杆菌检出率差异有统计学意义(χ~2=29.683,P0.01),不同年份的食品样品蜡样芽胞杆菌的分离率差异无统计学意义(χ~2=5.835,P0.05)。米面制品、即食凉拌类和腌卤制品是蜡样芽胞杆菌的主要污染食品。腹泻型毒素基因(hbl,nhe,bceT,cytK,entFM)的检出率远高于呕吐型毒素基因(ces和cer)。分离菌株对四环素、红霉素、克林霉素的耐药率分别为29.3%(17/58)、24.1%(14/58)和22.4%(13/58)。结论成都市市售食品中蜡样芽胞杆菌分离菌株携带毒力基因类型多样,对四环素、红霉素、克林霉素的耐药率较高,对食品安全具有潜在威胁。     

广州市市售食品中蜡样芽胞杆菌监测结果分析

目的 了解广州市市售食品中蜡样芽胞杆菌污染及分布情况, 发现危险因素。方法 2014~2018年共采集6类共2011份食品样品, 开展蜡样芽胞杆菌监测分析。结果 蜡样芽胞杆菌检出阳性样品共146份, 总体检出率为7.26%。其中6份样品蜡样芽胞杆菌检出值超过105 CFU/g。不同食品类别中小摊贩食品检出率最高, 达到了10.62%, 其次为烘焙食品(8.69%)、寿司(7.50%)、冷藏膳食(6.67%)、盒饭(6.36%)和熟制米面制品(5.00%)。第3季度检出率最高, 为8.77%, 其次为第2季度(7.98%), 最低的是第1季度(5.09%)。不同采样场所中采自小摊贩的食品蜡样芽胞杆菌检出率最高(11.21%), 其次为餐饮单位(9.31%)和农贸肉菜市场(8.07%), 最低的是超市(6.56%)。散装食品蜡样芽胞杆菌检出率(7.61%)高于预包装食品(5.38%)。中心城区食品蜡样芽胞杆菌检出率(9.24%)高于周边区(3.65%)。结论 广州市市售食品存在不同程度的蜡样芽胞杆菌污染, 部分食品存在安全隐患, 相关部门应针对性加强监管, 预防食源性疾病的发生。     

即食米面制品中蜡样芽胞杆菌分离鉴定及毒力基因研究

为探究即食米面制品中蜡样芽胞杆菌的污染状况及食源性蜡样芽胞杆菌中毒力基因的分布规律,以餐饮服务场所采集245份即食米面制品为蜡样芽胞杆菌的污染调查材料,通过国标法及持家基因分离鉴定得到49株蜡样芽胞杆菌阳性株,并对其进行13种毒力基因的PCR检测。结果表明:蜡样芽胞杆菌的平均检出率为10.61%(26/245),阳性检出样品主要为盒饭及米饭,其蜡样芽胞杆菌平均检出水平为3032 CFU/g,其中以盒饭的检出程度最高。49株分离菌株均检出两种或两种以上的毒力基因,非溶血性肠毒素基因nhe和entFM检出率最高,分别达到100%及91.84%,是分离菌株的主要毒力基因;溶血素基因hblA、hblC、hblD检出率分别为20.41%、38.78%和40.82%。同时携带nhe三个基因又携带hblA、hblC和hblD基因的强毒株有7株,占14.29%,且这7株菌均含有entFM基因。呕吐型毒力基因ces、cer、EM1仅2株检出,检出率为4.08%。本研究对即食米面制品中蜡样芽胞杆菌的监控、预警及爆发引起食物中毒后追踪其感染源和传播途径及构建基因指纹图谱库和分子溯源平台具有指导意义。     

蜡样芽孢杆菌LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆和生物信息学分析

为研究蜡样芽孢杆菌LJ01(Bacillus cereus LJ01)中亚硝酸盐还原酶(NiR)的酶学性质,获得高表达量的基因工程菌,本文对B.cereus LJ01的NiR序列进行了生物信息学分析,并将NiR基因克隆到表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,随后探究了不同诱导条件对重组NiR表达量的影响。结果表明NiR编码蛋白的理论分子量约为60 kDa,理论pI为5.47,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,是不具有跨膜结构的亲水性蛋白。随着诱导温度的升高,重组NiR的表达量逐渐减少,诱导温度为16℃时重组NiR表达量最高。在同一诱导温度下,NiR在pET-28a(+)-nir-BL21中的表达量明显高于pET-32a(+)-nir-BL21,因此选用pET-28a(+)-nir-BL21作为基因工程菌。从B.cereus LJ01中克隆了NiR基因,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21,为该重组NiR的理化性质研究和食源芽孢杆菌中NiR的异源表达奠定了基础。     

3种致病菌多重real-time PCR检测方法的建立及其在散装即食肉制品中的应用

建立一种同时快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法.以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌Sa442基因和蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因为靶基因设计引物和TaqMan探针...     

Shiga‐Toxin Genes and Genetic Diversity of Escherichia coli Isolated from Pasteurized Cow Milk in Brazil

This study evaluated the genetic similarity and prevalence of the stx1, stx2, eae, and ehxA genes in Escherichia coli isolated from pasteurized cow milk. Eighty‐seven E. coli isolates from pasteurized cow milk from 22 dairies located in northwestern Paraná state, Brazil, were analyzed. Genetic similarity was evaluated using enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence polymerase chain reaction (ERIC‐PCR) and repetitive extragenic palindromic sequence PCR (REP‐PCR). E. coli isolates were also analyzed by PCR to investigate the presence of the stx1, stx2, eae, and ehxA genes. ERIC‐PCR and REP‐PCR clustered 87 bacterial isolates in 76 and 81 genomic profiles, respectively. Both techniques revealed high genetic diversity among the E. coli isolates, confirming the possibility of their use in epidemiological studies. The stx1, stx2, eae, and ehxA virulence genes were not detected in E. coli isolates, indicating a low prevalence of Shiga toxin‐producing E. coli in milk produced in the region studied.     

食品中荧光假单胞菌聚合酶链式反应检测体系的建立和评价

建立用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测食品中荧光假单胞菌的方法。分别针对16～23S rRNA基因间隔区序列、gyrB基因以及通过生物信息学方法发掘到的4个种特异性基因设计6对检测引物,通过初步特异性实验,筛选出一对种特异性最佳的引物。最终建立以gyrB基因为检测靶点的PCR扩增体系,并对体系进行系统评价。结果表明:该方法可特异检测荧光假单胞菌的存在,纯DNA检测灵敏度为14.9fg/μL(2～3拷贝/μL),纯培养物检测灵敏度为2.8×102CFU/mL。豆奶样品经15h充分增菌可提高检测灵敏度至0.28CFU/25g。     

淡水小龙虾弧菌分离株毒力基因的筛选与检测方法的建立

目的：筛选湖北淡水小龙虾弧菌分离株毒力基因并建立一种特异、灵敏的检测方法。方法：应用分子生物学--聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,根据文献记载的弧菌属中6种不同的分离株CTX基因元件中的ctxA、RS1、zot基因,VPI毒力岛中的tcpA、toxT基因,RTX基因簇中的rtxC,以及toxR、T139、tcpH、toxRS、toxS、ctxAB基因序列设计PCR引物建立PCR检测方法。结果：该方法能够有效地对弧菌分离株毒力基因进行检测,简便快速、特异性强、检测周期短。     

基于ttr基因的mini-MPN-qLAMP法快速定量检测食品中沙门氏菌

该研究通过3管型微量MPN计数法（Mini Most Probable Number,mini-MPN）建立了一种快速定量检测食源性沙门氏菌的荧光定量环介导等温扩增（Quantitative Loop-Mediated Isothermal Amplification,qLAMP）方法。依据沙门菌属ttr基因设计了qLAMP和荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）引物,结合5 h BPW增菌和MPN计数法建立了mini-MPN-qLAMP沙门氏菌快速定量检测方法;使用两种人工污染样品对mini-MPN-qLAMP法进行验证,使用Bland-Altman分析比较不同检测方法检测结果的一致性。结果表明,建立的qLAMP法与qPCR法反应特异性均良好,纯培养时qLAMP法检出限为500 CFU/mL。通过Bland-Altman分析表明所建立的mini-MPN-qLAMP法在速冻乌米饭中检测结果与mini-MPN-qPCR、mini-MPN计数法、平板计数法相比均具有较高的一致性,r2≥0.994,检出限为-0.44 lg MPN/mL;而在速冻鸡胸肉中该法检测结果与mini-MPN-qPCR结果一致性最佳,r2=0.990,检出限为-0.64 lg MPN/mL。肉制品中腐败杂菌会影响mini-MPN计数和平板计数结果,mini-MPN-qLAMP可排除肉制品中腐败杂菌对检测结果的影响。该研究所建立的mini-MPN-qLAMP法简单易行,准确度高,可用于食品中沙门氏菌的快速定量检测。     

PCR法检测鱼及其制品中的鱼源性成分

目的:建立一种快速、特异、灵敏的鱼源性成分聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法:根据鱼线粒体基因组12S r RNA中的保守序列设计鱼源性特异性引物,进行PCR扩增,建立鱼源性成分检测方法;对24种鱼及鸡、牛、羊、猪、鸭、虾6种常见的易混于鱼制品的动物源性成分进行特异性检测;将草鱼肉混入其他动物肉中,混合均匀后提取DNA进行PCR扩增,确定肉样水平的检测灵敏度;将草鱼DNA混入其他动物DNA中,以混合后的DNA为模板进行PCR扩增,确定DNA水平的检测灵敏度。结果:该方法能特异性的对鱼源性成分进行快速检测,检测灵敏度达0.5%。结论:该方法能对食品中是否含有鱼源性成分进行初筛,到达快速检测的目的,对防止食品掺假、维护消费者利益、规范市场秩序有重要意义。     

数字聚合酶链式反应技术在食品安全检测领域的研究应用进展

数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction,dPCR）作为一项新兴的基于单分子目标基因扩增的绝对定量技术,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文综述了商业化dPCR技术在转基因成分、动物源性成分、食源性致病微生物定量检测等食品安全领域的研究进展,讨论了dPCR应用中技术难题的解决,并在此基础上展望了该技术在食品安全检测领域的发展前景。