可视化-跨越式滚环等温扩增技术检测鼠肉掺假

目的 建立可视化-跨越式滚环等温扩增技术检测肉制品中鼠肉掺假的分析方法.方法 选取鼠的线粒体cyt b基因为靶基因,设计并筛选出一对引物,选择9个不同物种的新鲜肌肉组织样本为研究对象,验证跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle isothermal amplification,SRCA...     

跨越式滚环等温扩增可视化检测羊肉中鸭肉源成分

为可视化检测羊肉中鸭肉源成分,该研究将跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术与荧光技术相结合,以生长激素(Growth hormone,GH)基因为靶基因分别设计并筛选羊、鸭特异性引物,拟建立可视化SRCA检测方法。对该方法进行特异性、灵敏度和检出限试验。结果显示：山羊和绵羊样品呈现绿色荧光,判定为阳性,13种非羊样品呈现橙黄色荧光,判定为阴性;鸭样品为阳性,14种非鸭样品均为阴性;表明该方法特异性良好。可视化SRCA分别检测羊、鸭DNA的灵敏度均为2.0×101 fg/μL。可视化SRCA检测羊肉中鸭肉源成分的检出限为0.001%(w/w)。对29份市售羊肉样品中鸭肉源成分的检测得知,可视化SRCA法检出率为17.24%,行标NY/T 3309—2018中方法检出率为10.34%。该方法经济、简便,结果肉眼可见,更适用于条件相对落后的实验室或资源相对匮乏的基层检测机构。     

跨越式滚环扩增(SRCA)结合金纳米粒子可视化检测食品中的沙门氏菌

沙门氏菌是引起全球人类腹泻病的主要病因,严重危害人畜健康。传统检测方法耗时长,步骤繁琐,因此开展快速简便灵敏的可视化检测方法,具有重要意义。本文设计能与靶序列结合的探针,将其与金纳米粒子(AuNPs)结合。经跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)扩增的靶序列,高温变性后成为单链,其与金纳米粒子上的探针结合后,释放出金纳米粒子,在MgSO4的作用下,聚集呈现肉眼可见的蓝色,判定为阳性,阴性为紫色。依此,建立一种简便、快捷、灵敏的可视化检测方法。结果表明:该方法特异性良好,能够区分8株沙门氏菌阳性与8株非沙门氏菌阴性。可视化检测的灵敏度为5.5×100 CFU/mL。将牛奶样品人工污染沙门氏菌,检出限为3.7×100 CFU/mL。在50份实际样品检测中,与GB 4789.4-2016方法进行比较,该方法敏感性为100.00%,特异性为97.87%,符合率达到98.00%。本文建立的SRCA-AuNPs可视化检测方法,具有较高的应用价值,结果肉眼可见,适合于现场可视化检测和基层单位使用。     

食品中沙门氏菌FTA膜结合跨越式滚环等温扩增检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的简便和快速现场检测,本研究采用FTA膜(Flinders technology associates,FTA)结合跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)方法(FTA-SRCA)建立一种新型的沙门氏菌检测方法.利用FTA膜快速提取...     

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆

将跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)与荧光技术相结合,建立一种实时荧光SRCA技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法。对DNA提取方案进行评估,以大米的特异性基因(PDL、SPS、rbcL、GOS9)为靶序列设计引物,筛选适宜的引物,优化扩增反应条件结合荧光技术建立检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法,并对该方法进行评价。结果表明,建立的实时荧光SRCA方法检测大米DNA的灵敏度为8.45×101 fg/μL,经特异性评价证实其特异性良好,在人工模拟掺伪检测中建立掺伪比例的对数与Ct值的线性关系,线性方程为y=6.618x+7.651(R2=0.993),可准确检出蜂蜜中低至1%的大米糖浆成分。该方法灵敏度高,检出限低,能够快速、准确检测蜂蜜掺伪大米糖浆,为蜂蜜掺伪的快速检测提供了新思路。     

可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

建立一种新型的核酸体外等温扩增方法--可视化跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)检测沙门氏菌。根据沙门氏菌stn基因序列设计引物,进行特异性验证。测定该技术的灵敏度以及人工污染鸡肉样品的检出限。通过检测多种实际食品样品,评价SRCA方法的敏感性、特异性和符合率。研究结果表明:所有沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,说明引物特异性良好。SRCA方法检测沙门氏菌DNA的灵敏度为5.6×10~0fg/μL,检出限为3.8×10~1CFU/mL;PCR方法的灵敏度为5.6×10~2fg/μL,检出限为3.8×10~3CFU/mL。该方法检测30个实际样品的检出率为13.33%,并与GB 4789.4-2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%,96.30%和96.67%。结论:可视化跨越式滚环等温扩增技术具有操作简便,特异性强,灵敏度高,检出限低,检测成本低,对试验设备要求低等优点,适用于基层单位对食品中沙门氏菌的快速检测。     

滚环等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是影响人类食品安全的重要因素。人类食源性致病菌致病率的逐年上升,引起世界广泛关注。滚环等温扩增(rolling circle amplification, RCA)技术因具有高特异性、高灵敏度、稳定、操作简单等优点,在食源性致病菌检测中具有广泛的应用前景。近年来以滚环等温扩增技术为基础,针对食源性致病菌的检测新技术不断得到发展。本文概述了滚环等温扩增技术的基本原理、技术特点、在食品微生物快速检测方面的应用、存在的不足和解决措施,指明研究发展新方向,旨在为食源性致病菌在快速、高通量检测需求上增加新方法,对食品安全监管具有重要意义。     

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术检测单核细胞增生李斯特氏菌.根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定.通过检测70种...     

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测食品中的志贺氏菌

该研究建立一种实时荧光跨越式滚环等温扩增(real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)技术快速检测志贺氏菌(Shigella).该方法以志贺氏菌的ipaH基因设计引物,使用32株不同菌株对RF-SRCA方法的特异性进行分析,...     

可视化SRCA技术检测转基因大豆及其制品的研究

为保障转基因大豆的可追溯性以及消费者的知情权和选择权,开发快速、灵敏、准确的转基因大豆检测方法显得尤为重要.文章建立了一种用于检测转基因大豆及其制品的可视化跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术.根据抗除草剂草甘膦CP4-EPSPS基因设计引物,...     

Saltatory rolling circle amplification for sensitive visual detection of Staphylococcus aureus in milk

Monitoring Staphylococcus aureus with high sensitivity is very important for ensuring milk quality and food safety. In this study, we used a rapid nucleic acid isothermal amplification method, saltatory rolling circle amplification (SRCA), for the detection of Staph. aureus in milk. The results of the SRCA method can be assessed visually by the presence of white precipitate or by fluorescence measurement. Thirteen Staph. aureus strains and 31 non-Staph. aureus strains were used to evaluate the specificity of SRCA. The method exhibited excellent detection of Staph. aureus genomic DNA at a concentration of 7.8 × 10¹ fg/µL when assessed by visible precipitate, and at 7.8 × 10⁰ fg/µL when detected by fluorescence after addition of the fluorochrome SYBR Green I. In artificially inoculated milk, the detection limits of SRCA were 5.6 × 10² cfu/mL by precipitate and 5.6 × 10¹ cfu/mL by fluorescence, respectively. Compared with conventional PCR approaches, the SRCA assay achieved at least 100-fold higher sensitivity. Moreover, the sensitivity, specificity, and accuracy of the SRCA-based system were calculated to be 100.00, 97.73, and 97.78%, respectively. These results indicate that SRCA has potential application as a sensitive and visual technique for the detection of Staph. aureus in milk.     

跨越式滚环等温扩增技术结合CRISPR/Cas12a定量检测海产品中的副溶血性弧菌

将CRISPR/Cas12a系统与跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle amplification,SRCA)相结合,建立一种快速、灵敏定量检测海产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的方法(SRCA-Cas12a)。通过SRCA扩增靶标DNA,CRISPR/Cas12a系统识别靶标DNA并裂解单链报告探针,从而建立SRCA-Cas12a检测方法。分析该方法的特异性与灵敏度,并进行加标回收实验和实际样品检测。结果显示该方法可区分副溶血性弧菌和其他食源性致病菌,特异性良好。在最优检测体系下,建立了副溶血性弧菌菌液浓度的对数与荧光信号强度的线性关系,线性方程为y=1.847 2x+2.473 8(R²=0.986 6),检出限为3.6 CFU/mL(R_SN=3)。在人工污染样品中副溶血性弧菌的加标回收率为95.5%～104.4%。在实际样品检测中,该方法的敏感性为100.0%、特异性为95.2%、符合率为97.2%。本研究所建立的SRCA-Cas12a方法具有特异性好、检测限低的优点...     

实时荧光跨越式滚环等温扩增结合PMA检测虾产品中的活副溶血性弧菌

目的：为快速检测虾产品中的活副溶血性弧菌,建立一种实时荧光跨越式滚环等温扩增（real-time fluorescent saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA）与叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）染料相结合的检测方法。方法：依据副溶血性弧菌的特异性基因toxR设计并筛选引物,对PMA-RF-SRCA检测方法进行特异性、灵敏度及检出限分析,并与PMA-实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法进行对比。对76 份样品进行检测,以GB 4789.7—2013方法为标准,对PMA-RF-SRCA方法的相对敏感性、相对特异性、相对符合率进行计算,以对本方法的实用性进行评估。结果：此方法的引物特异性良好,12?株副溶血性弧菌结果均呈阳性,18?株非副溶血性弧菌结果均呈阴性;PMA-RF-SRCA法灵敏度为3.2×100?CFU/mL,检出限为2.08×101?CFU/g,此方法的灵敏度是PMA-real-time PCR的100?倍。经过实际样品检测,PMA-RF-SRCA方法的敏感性、特异性、符合率分别为100.00%、96.00%和98.68%。结论：PMA-RF-SRCA方法特异性强、灵敏度高,可用于虾产品中的活副溶血性弧菌的检测与筛查。     

可视化LAMP检测常见肉制品中猪肉成分

根据GenBank中公布的猪线粒体色素细胞b基因序列设计6 条特异性环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,通过简化线粒体DNA提取步骤,优化反应体系,以常见的牛、羊、鸡、鸭、马、驴肉为阴性对照验证该方法的特异性,掺假率梯度稀释以验证该LAMP法的最低检测限,建立常见肉制品中猪肉成分的可视化LAMP检测方法。结果表明：该方法提取目的基因操作简单、稳定,该可视化LAMP检测法以4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚钠盐为指示剂,能准确检测出常见肉类中猪肉是否掺杂,检测结果肉眼可见,灵敏度为10 pg/μL。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测猪肉中的假单胞菌

根据假单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,并向反应体系中加入饱和型核酸染料Eva Green,利用实时荧光检测仪,建立假单胞菌属实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)。研究中对62株假单胞菌的16S rDNA基因通过DNAMAN软件进行序列比对后,针对共有片段设计扩增引物。对扩增体系进行了优化,优化结果经电泳鉴定。通过12株假单胞菌和23株非假单胞菌进行特异性验证,并比较了实时荧光LAMP与普通LAMP的灵敏度,对人工污染样品的检出限进行了测定。结果表明,特异性验证中12株假单胞菌为阳性,23株非假单胞菌为阴性。实时荧光LAMP检测纯菌的灵敏度为36 CFU/mL,是普通LAMP灵敏度的10倍。人工污染样品的检出限为1.73×10~3 CFU/g。本研究中建立了一种检测冷鲜猪肉中假单胞菌属的方法,实现了多个菌种的同时检测,避免了单一菌种检测的局限性,该方法快速、准确、灵敏度高,可在2 h内完成冷鲜猪肉中假单胞菌的检测。