盐渍藠头盐水细菌多样性及基因功能预测分析

采用MiSeq高通量测序技术对来凤地区盐渍藠头盐水细菌多样性进行解析,并采用PICRUSt技术对其基因功能进行预测。结果表明,99.58%的基因序列长度为425～451 bp,基本覆盖16S rRNA V3-V4区序列;优势细菌门为硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）,平均相对含量分别为43.94%、33.12%和18.21%;优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和嗜热油菌属（Thermoleophilum）,平均相对含量分别为30.28%、18.21%和16.13%;共有219个核心操作分类单元（OTU）,包含的序列数占总序列数的75.56%;盐渍藠头盐水中可能共有大量具有较强氨基酸转运和代谢功能的细菌类群。     

建始地区酸豇豆盐水细菌多样性及乳酸菌分离鉴定

该研究采用MiSeq高通量测序技术对酸豇豆盐水的细菌多样性进行了解析,并通过纯培养方式分离了其中的乳酸菌。结果发现,细菌以硬壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为主,平均相对含量分别为84.41%和10.52%;细菌属以乳酸杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和片球菌属（Pediococcus）为主,平均相对含量分别为57.02%、9.33%、7.07%、4.73%和3.40%;发现44个操作分类单元（OTU）存在于所有样品中,所包括序列占总序列数的25.06%,其中有6个、11个和13个分别被鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）、魏斯氏菌属（Weissella）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）,所含序列平均含量分别为4.61%、4.97%和14.46%;通过纯培养共分离出了13株乳酸菌,其中12株被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。由此可见,乳酸杆菌为建始地区酸豇豆盐水中的优势细菌,且乳酸杆菌主要为植物乳杆菌。     

南宁地区酸柠檬细菌多样性及潜在功能分析

为解析广西南宁市家庭自制酸柠檬中的细菌群落结构及潜在功能,该研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术对酸柠檬样品细菌群落多样性进行分析,并采用PICRUSt软件对其基因功能和表型进行预测。结果表明,酸柠檬中微生物多样性较高,不同样品间优势细菌含量差异较小。优势细菌门为变形菌门（Proteobacteria）、硬壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）,累计平均相对含量达98.23%;优势细菌属为劳尔氏菌属（Ralstonia）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、诺卡氏菌属（Nocardia）、假单胞菌属（Pelomonas）和别样杆菌属（Alistipes）,平均相对含量分别为66.13%、8.18%、2.87%、1.27%、1.01%。酸柠檬中具有氨基酸转运与代谢、能量生产和转换功能的细菌序列占总序列的比例较高,均＞7%,可促进酸柠檬独特风味的形成。     

云南泡藠头和泡辣椒中细菌与真菌群落结构和多样性分析

采用高通量测序技术对云南省昆明市、红河州和文山州地区泡藠头和泡椒的细菌真菌多样性进行解析。基于Shannon指数的α-多样性分析结果表明,3个地区泡菜的微生物多样性、优势度和均匀度存在差异,文山地区泡藠头中细菌群落的多样性最高,且均匀度较好;红河地区泡藠头和泡辣椒真菌菌群结构最丰富。其中,泡藠头和泡椒中优势细菌门为厚壁菌门(Firmicutes)和变形杆菌门(Proteobacteria),相对丰度分别为99.21%和58.19%;优势细菌属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和魏斯氏菌属(Weissella),相对丰度分别为98.07%、19.46%和17.70%;文山和红河泡藠头和泡辣椒的优势真菌属为接合酵母菌属(Zygosaccharomyces),昆明泡藠头和泡辣椒的优势真菌属为毕赤酵母属(Pichia)。研究表明不同地区、不同种类的泡藠头与泡椒中微生物多样性存在差异。该研究初步揭示了云南附近地州的泡藠头与泡椒中微生物的多样性,为提高云南特色发酵蔬菜的品质提供理论指导。     

恩施地区腊肠的细菌多样性

为解析恩施地区腊肠中细菌的多样性,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）和MiSeq高通量测序技术相结合的方法对采集自该地区的5 个腊肠样品中的细菌进行测定。结果表明：恩施腊肠样品中含有大量的共有细菌类群,其优势细菌主要隶属于硬壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）,二者的平均相对含量分别为57.01%和30.43%;优势细菌属中平均相对含量最高的为环丝菌属（Brochothrix）。     

基于高通量测序技术的广西咸梅细菌多样性分析

采用Illumina MiSeq 高通量测序技术对广西地区9 份咸梅样品的细菌多样性和群落结构进行解析。结果表明：咸梅样品中特有细菌种类较多但含量少,不同样品中细菌丰富度和多样性存在差异。优势细菌门分别为变形菌门（Proteobacteria）、硬壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）,平均相对含量分别为66.97%、21.50%、5.30%和4.20%,优势细菌属及其相对含量分别是雷尔氏菌属（Ralstonia）53.28%、乳杆菌属（Lactobacillus）10.36%、伯克氏菌属（Burkholderia）6.16%、诺卡氏菌属（Nocardia）2.74%、芽孢杆菌属（Bacillus）1.75%、假单胞菌属（Pelomonas）1.35%和另枝菌属（Alistipes）1.00%。在对优势细菌属进行相关性分析后发现,雷尔氏菌属（Ralstonia）与伯克氏菌属（Burkholderia）和假单胞菌属（Pelomonas）均呈显著正相关（P<0.05）,芽孢杆菌属（Bacillus）与另枝菌属（Alistipes）之间存在显著正相关（P<0.05）,还有部分优势菌属间存在拮抗或竞争关系,乳杆菌属（Lactobacillus）与雷尔氏菌属（Ralstonia）和伯克氏菌属（Burkholderia）均呈显著负相关（P<0.05）。     

襄阳大头菜腌制液膜醭细菌群落结构研究

使用Miseq高通量测序技术对3个襄阳大头菜腌制液膜醭样品的细菌微生物群落结构进行了解析。在门水平上,变形菌门（Proteobacteria）和硬壁菌门（Firmicutes）平均含量分别为62.12%和34.13%。在属水平上,相对含量＞1.0%的细菌属分别为盐单胞菌（Halomonas）、色盐杆菌属（Chromohalobacter）、海杆菌属（Marinobacter）、盐厌氧菌属（Halanaerobium）、四联球菌（Tetragenococcus）和碱杆菌属（Alkalibacillus）,其相对含量为26.31%、16.49%、8.13%、24.87%、6.13%和1.16%。在操作分类单元水平（OTU）上,发现14个平均相对含量＞1.0%的核心OTU,其中OTU4083（隶属于盐厌氧菌属）、OTU4400（隶属于色盐杆菌属）和OTU846（隶属于盐单胞菌属）的累计平均相对含量为39.50%。由此可见,襄阳大头菜膜醭中的细菌微生物主要由隶属于变形菌门和硬壁菌门的6个属构成,且膜醭共有大量的核心细菌菌群。     

基于MiSeq高通量测序技术渣豆酱微生物类群研究

该研究采用MiSeq高通量测序技术对鹤峰地区渣豆酱中细菌和真菌多样性进行了解析。结果发现,硬壁菌门（Firmicutes）为优势细菌门,芽孢杆菌属（Bacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）为优势细菌属,平均相对含量分别为92.0%、56.87%和24.28%;子囊菌门（Ascomycota）为优势真菌门,青霉属（Penicillium）、耐碱酵母属（Galactomyces）和接合酵母属（Zygosaccharomyces）为优势真菌属,平均相对含量分别为82.57%、19.42%、17.09%和16.12%;经Mood-median检验发现,细菌的丰度显著低于真菌（P＜0.05）,而多样性差异不显著（P＞0.05）;经相关性分析发现,芽孢杆菌属与德巴利酵母属呈显著负相关（R=-0.997,P＜0.05）,乳酸杆菌属与念珠菌等真菌属均呈显著正相关（P＜0.05）,且相关系数均大于0.999。由此可见,鹤峰地区渣豆酱中细菌主要为芽孢杆菌属和葡萄球菌属,真菌主要为青霉属、耐碱酵母属和接合酵母属。     

基于高通量测序技术分析豆腐乳中微生物多样性

采用高通量测序技术对4种不同来源发酵豆腐乳中微生物的多样性和丰度进行比对分析。结果表明,纯种发酵与自然发酵豆腐乳样品微生物菌群多样性差异较大,从不同豆腐乳样品中共检测得到3个优势细菌门（平均相对丰度＞1%）、6个优势真菌门、13个优势细菌属和19个优势真菌属;共有优势细菌属为假单胞菌属（Pseudomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、魏斯氏菌属（Weissella）、不动杆菌属（Acinetobacter）和明串珠菌属（Leuconostoc）,其中,假单胞菌属在自然发酵豆腐乳中平均相对丰度最高（62.05%）;共有优势真菌属为酵母属（Saccharomyces）、曲霉属（Aspergillus）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）、短梗霉属（Aureobasidium）、假丝酵母属（Candida）和有孢圆酵母属（Torulaspora）,其中酵母属在纯种发酵豆腐乳中平均相对丰度最高（44.42%）。     

盐渍辣椒细菌多样性分析

以盐渍线椒和盐渍米椒为研究对象,采用454焦磷酸测序技术,探究盐渍辣椒细菌的群落组成及相对丰度,为盐渍辣椒优势优良菌种的筛选及发酵辣椒菌种资源库的建立提供理论支持。结果表明,盐渍线椒已知分类的细菌可归属到8个门、15个纲、26个目、31个科、94个属、101个种。盐渍米椒已知分类的细菌可归属到6个门、15个纲、29个目、44个科、58个属、42个种。盐渍线椒主要的细菌门有蓝藻细菌(Cyanobacteria,77.01%)、变形菌门(Proteobacteria,14.78%)和厚壁菌门(Firmicutes,6.36%),盐渍米椒优势细菌门为Proteobacteria(51.5%)和Firmicutes(46.92%)。盐渍线椒和盐渍米椒相对丰度大于1%的细菌属共有19个,盐渍线椒中优势菌属为乳球菌属(Lactococcus,24.51%)和根瘤菌属(Rhizobium,13.17%);盐渍米椒中优势菌属为盐厌氧菌属(Halanaerobium,38.99%)、海螺菌属(Marinospirillum,24.86%)、色盐杆菌属(Chromohalobacter,12.36%)和盐单胞菌属(Halomonas,9.67%)。     

不同连接肽在硫酸软骨素酶 ABC I重组表达中的应用研究

硫酸软骨素酶ABC I（ChSase ABC I）是一类能够将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺多糖降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。该研究将硫酸软骨素酶ABC I基因与麦芽糖结合蛋白（MBP）基因分别用FFFFF和RRRRR两种连接肽连接，并克隆到pMAL-c2X载体上，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)高效表达。结果表明，重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为716.5 IU/L发酵液和1.15 IU/mg蛋白，重组酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为741.0 IU/L发酵液和1.13 IU/mg蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明，重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子质量均为130 kDa，并且都为可溶性蛋白。     

硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ的高效融合表达及其酶学性质研究

目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ（chondroitinase ABC Ⅱ,ChSase ABC Ⅱ）的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABC Ⅱ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础。方法:在优化ChSase ABC Ⅱ基因原始序列的基础上,构建重组质粒pET-28a-His-ChSase ABC Ⅱ并优化其表达条件;利用亲和层析得到带有多聚组氨酸标签（polyhistidine-tag,His-tag）的ChSase ABC Ⅱ融合蛋白后,研究了His-ChSase ABC Ⅱ的部分酶学性质。结果:构建的His-ChSase ABC Ⅱ融合蛋白表达系统能在大肠杆菌中实现可溶性表达;在表达宿主为E.coli BL21(DE3)和诱导剂（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）浓度为125 μmol/L的优化条件下,发酵液酶活力可达到7206.83±184.27 IU/L;纯化后的His-ChSase ABC Ⅱ酶比活力为22.02±0.39 IU/mg蛋白,最适pH和温度分别为7.5和40 ℃,其在30~40 ℃条件下较为稳定,且半衰期在2 h以上。His-ChSase ABC Ⅱ能特异性有效分解硫酸软骨素,其K_m值为10.4±0.8 μmol/L,K_cat值为9.4±0.2 s?1。结论:本论文通过基因优化和融合表达等策略实现了His-ChSase ABC Ⅱ的高效表达和纯化。此外,His-ChSase ABC Ⅱ的酶学性质可基本满足其在医药和营养产品工业生产中的应用需求。     

响应面法优化鹅全骨硫酸软骨素的酶法提取工艺

采用麻阳鹅鹅全骨为原料,以硫酸软骨素（chondroitin sulfate,CS）的提取率为指标,对运用碱提、复合酶解、醇沉法提取CS的工艺进行研究,确定使用胃蛋白酶进行酶解后,通过单因素试验和响应面优化试验,应用Box-Behnken实验设计建立二次多项式数学模型,进行响应面分析,确定胃蛋白酶酶解提取CS的最佳工艺参数。结果表明：碱提、复合酶解、醇沉法胃蛋白酶酶解提取鹅全骨CS的最佳工艺为加酶量1.55 g/L、酶解时间6.4 h、酶解温度42 ℃、pH值3.09,在此条件下CS的提取率为12.13%;通过高效液相色谱测定可知,提取物为CS和盐酸氨基葡萄糖。     

基于石石墨烯的丁酰胆碱酯酶传感器法快速测定水产品中的孔雀石绿

本文以壳聚糖（Chitosan）和石墨烯GS为复合修饰材料,通过交联技术固定化丁酰胆碱酯酶（BuChE）制备了BuChE/CS/GS/GCE纳米酶传感器,建立了一种快速而灵敏测定水产品中孔雀石绿（Malachite Green,MG）的方法。研究了BuChE/CS/GS/GCE纳米酶传感器修饰材料、电解质、固定酶量、抑制时间等对酶传感器响应电流的影响,优化了酶传感器法测定MG的试验条件,结果如下：修饰材料CS与GS之比为1:2、0.10 mol/L的PBS为电解质、pH 7、抑制时间为11 min、酶活是4.0 U/mL。在此条件下,该酶传感器的响应电流与电解质溶液中MG的浓度在1.0×10-7~1.1×10-6 mol/L范围内成线性关系（Ip=-6.97 C MG+22.81,R2=0.9885）,最低检测限为2.80×10-8 mol/L（S/N=3）,加标回收率在96.36%~99.78%。该方法用于水产品中MG的测定具有简捷、灵敏度高、选择性好、稳定性好、重复性好等优点,用于水产品中孔雀石绿的快速检测是可行的。     

基于脂质体反应器的酶纳米生物传感器在敌敌畏快速检测中的应用

采用脂质体技术制备乙酰胆碱酯酶的微反应器,并以微反应器、壳聚糖和二氧化硅为基质,构建以多层纳米酶膜修饰电极为核心的有机磷农药残留快速检测酶电化学生物传感器。结果表明,酶脂质体微反应器平均粒径为（7.26±0.75）μm;修饰电极多层酶膜的最佳层数为6 个双层;以敌敌畏作为有机磷农药模型,分别在其浓度为0.25～1.75 μmol/L和2.00～10.00 μmol/L线性范围内,传感器的峰电流值与乙酰胆碱酯酶抑制率呈现出良好的线性关系,回归方程分别为I=28.58C＋5.35和I=2.38C＋51.25;最低检出限为（0.72±0.065）μg/L（信噪比为3）;此新型酶纳米生物传感器具有良好的灵敏度、重复性和选择性。     

重组融合蛋白MBP-PAI的表达、纯化及酶活测定

为了解决亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase,PAI)在大肠杆菌中形成包涵体的问题,选择麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding Protein,MBP)标签和低温诱导表达系统pColdV,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(pCold-Mpai),并对其诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白MBP-PAI成功表达,重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度15℃、IPTG添加量0.1 mmol/L、诱导时间12 h,在该诱导条件下,与未融合MBP的PAI相比,MBP-PAI的可溶性表达量为后者的18倍、酶活为后者的1.5倍。经过MBPTrap HP亲和层析柱纯化后,MBP-PAI纯蛋白质的比酶活为1.58 U/mg,能够转化亚油酸形成反10,顺12-共轭亚油酸。     

硫酸软骨素微生物生产展望

硫酸软骨素（CS）为糖胺聚糖家族一员,具有广泛的应用。采用与CS生物合成前体具有相似结构的细菌荚膜多糖为底物,经化学或生物修饰可生产CS及其类似物,是一种较有希望的非动物源性CS生产方式。本文对相关研究作一综述。     

硫酸软骨素微生物生产展望

硫酸软骨素(CS)为糖胺聚糖家族一员,具有广泛的应用。采用与CS生物合成前体具有相似结构的细菌荚膜多糖为底物,经化学或生物修饰可生产CS及其类似物,是一种较有希望的非动物源性CS生产方式。本文对相关研究作一综述。     

鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌细胞抑制作用

探究鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌细胞的生长抑制能力,并初步确定影响结直肠癌细胞生长的主要原因。选取3株具有代表性的结直肠癌细胞Caco-2、HCT-116、SW480,采用CCK-8法测定细胞生长曲线、硫酸软骨素对癌细胞增殖的抑制能力;以其中一株结直肠癌细胞HCT-116为模型,用流式细胞仪测定其周期和凋亡情况,用细胞核染色法观察处理前后细胞形态,结合caspase-3凋亡酶活力的测定,考察鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌细胞的促凋亡能力,并初步确定作用途径。研究结果表明,鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌细胞Caco-2、HCT-116、SW480的增殖具有一定抑制作用,最高抑制率分别为70.94%、90.00%和75.00%,明显高于阳性对照处理组;处理后,细胞周期G1/G0期比例升高至88.56%,S期比例降低至4.47%,阻滞细胞G1/G0期;同时,使用鲟鱼硫酸软骨素处理细胞后,细胞形态发生变化,出现细胞核固缩以及细胞破碎等现象,细胞主要的凋亡酶活力显著升高,酶活力可达1 645 IU/μg,使细胞发生凋亡,凋亡率可达63.73%。研究结果证明,鲟鱼硫酸软骨素具有促进结直肠癌细胞凋亡、抑制细胞增殖的能力。     

硫酸软骨素二糖对疲劳致小鼠肾脏炎症的改善作用

目的:研究硫酸软骨素二糖对疲劳诱发的肾脏炎症的改善作用。方法:24只Balb/c小鼠随机分成四组:正常组(N组)、疲劳应激组(M组)、正常小鼠干预硫酸软骨素二糖组(150 mg/kg·bw)(CS组)和疲劳应激小鼠干预硫酸软骨素二糖的(150 mg/kg·bw)组(S组)。将M组和S组小鼠置于电动轮跑步机上,速度为20r/min,跑步时间为3 h,持续运动2 d后休息5 d。实验周期为16 d,共运动6 d。随后测定各组小鼠肾脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量以及转化生长因子(TGF-β1)、核转录因子(NF-κB)、白介-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的mRNA表达量和NF-κB、IL-6、MCP-1的蛋白质表达量。结果:与N组相比,M组小鼠肾脏中SOD活性降低,MDA含量、TGF-β1的mRNA表达量以及NF-κB、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白质的表达量均极显著升高(p<0.01)。与N组相比,CS组小鼠肾脏SOD活性极显著提高(p<0.01)。与M组相比,S组小鼠肾脏SOD活性显著升高(p<0.05),MDA含量、IL-6以及MCP-1的mRNA表达量均极显著降低(p<0.01),IL-6以及MCP-1的蛋白质表达量均显著降低(p<0.05)。结论:硫酸软骨素二糖对疲劳引发的小鼠肾脏炎症具有显著的改善作用,且其机理可能与其改善肾脏氧化应激状态有关。