八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体的构建及对人参的遗传转化

将八氢番茄红素合成酶基因重组于植物双元表达载体pBin438,得到重组质粒pBin438PSY.用冻融法将其导入农杆菌EHA101中,采用叶盘法转化人参愈伤组织,经诱导与筛选,获得了潮霉素抗性植株。提取抗性植株总DNA,通过PCR扩增和PCR-Southern杂交检测,筛选出了整合有外源基因的抗性细胞系。为进一步研究八氢番茄红素合成酶基因在人参中的表达及生物学功能的研究奠定了基础。     

诱导条件下雨生红球藻虾青素合成相关基因的表达特征分析

用脱落酸(ABA)和氮饥饿加高光诱导雨生红球藻,研究在胁迫条件下虾青素在细胞内积累的变化以及虾青素合成基因的表达模式。结果表明,在诱导条件下雨生红球藻细胞内虾青素积累明显。半定量RT-PCR结果表明,在虾青素合成酶系基因中八氢番茄红素合成酶基因(psy)、八氢番茄红素脱氢酶基因(pds)在诱导一段时间内mRNA水平一直在升高,在诱导后期mRNA依然具较高水平,胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)、胡萝卜素酮化酶基因(bkt)在诱导一段一段时间后mRNA水平升高后又略有下降,而番茄红素环化酶基因(lcy)则不受这些诱导条件的调控,一直处于较高水平的表达。虾青素合成基因表达模式的差异表明这些基因分子调控机制的差异。     

crtE、crtY、crtI、crtB基因共调控提高β-胡萝卜素产量

代谢合成途径优化的关键在于途径中多个基因表达的调控,本研究使用不同强度启动子对代谢通路中多个相关基因同时调控以提高大肠杆菌β-胡萝卜素产量。将来源于P.agglomerans的4个基因crtE、crtY、crtI、crtB,通过Golden Gate DNA方法与不同强度启动子组合得到质粒库,并转化到底盘细胞中进行颜色筛选。筛选得到crtE、crtY、crtI、crtB启动子组合各不相同的菌株,β-胡萝卜素产量在0.64~8.82mg/g,最高产量比对照提高了65.2%。本研究验证了通过Golden Gate组装建库对代谢通路多个基因同时调控以提高目的产物产量的可行性。     

耻垢分枝杆菌海藻糖合成酶基因TreS的克隆及其在大肠杆菌中的表达

耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）在环境胁迫下具有合成海藻糖的能力。实验采用PCR的方法，克隆了来源于耻垢分枝杆菌的一段核苷酸序列，与已报道的海藻糖合成酶有60％以上同源性，推测该基因的编码产物具有海藻糖合成酶的活性，为进行其功能验证而在大肠杆菌中进行了表达。目的蛋白以可溶性蛋白为主，约占细胞可溶性总蛋白48％，为目前相关报道的最高值。经活性测定，表达的重组酶无需复性，能够催化麦芽糖生成海藻糖，在20℃反应20h对麦芽糖的转化率可达61％，具有较高的应用价值。     

黑松银松素合成酶的cDNA克隆及表达研究

松萎蔫病是由松材线虫引起的一种危害性极大的森林病害,为研究黑松对松材线虫的抗性机制,本文利用RT-PCR技术对黑松体内经转录组分析获得的与银松素合成酶mRNA高相似度的序列进行扩增,获得了银松素合成酶cDNA,然后将此银松素合成酶基因(PSL)克隆到表达载体pET-15b上,构建了重组表达质粒pET-15b-PSL,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)后构建工程菌,通过IPTG诱导,工程菌高效表达重组蛋白,经Ni 2+螯合柱亲和层析得到了纯化重组银松素合成酶。该研究为了解黑松银松素合成酶的功能及松萎蔫病抗性松树的培育奠定了基础。     

石柱参人参皂苷合成酶基因SS的克隆与序列分析

以石柱参近缘种野生山参的人参皂苷合成酶基因SS为模板,利用NCBI中的primer-BLAST设计特异性引物,应用PCR技术从石柱参叶片基因组DNA克隆了SS基因。序列分析显示,克隆的基因片段为1 285 bp,能够编码25个氨基酸以上的ORF (Open Reading Frame)有10个,其中最长能够编码295个氨基酸。NCBI序列对比显示,该基因与人参的人参皂苷合成酶基因SS的同源性为97. 05%,与西洋参的人参皂苷合成酶基因SS的同源性为96. 63%。这些数据表明,从石柱参克隆的基因为其人参皂苷合成酶基因SS。     

假单胞菌中聚羟基脂肪酸酯合成酶基因的克隆与分析

大多数二型聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHA）合成酶（PhaC）发现于假单胞菌中，其基因组成形式为两个PhaC基因中间有一个PAH降解酶PhaZ基因，根据已知的假单胞菌PHA合成酶基因区域的特殊结构，设计了采用PCR方法从假单胞菌中克隆PHA合成酶基因的克隆方案，并成功地对一株硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens）和一株石竹伯克霍尔德氏菌（Burkholderia caryophylli）中的PHA合成酶基因进行了克隆。将克隆得到的phaC1，phaZ和phaC2 3个基因所编码的氨基酸序列与其他6株已知PHA合成酶基因的假单胞菌的相应序列进行比较，发现这3个蛋白质在假单胞菌中的相似性很高，由phaC1,phaZ和phaC2 3个基因所组成的基因区域在假单胞菌中非常保守，从对PhaC1,PhaZ和PhaC2的系统进化树分析可以发现，这3个蛋白质与整个PHA合成酶基因区域的系统进化树有着一致的结构。这表明假单胞菌中的PHA合成酶基因区域可能起源于共同的祖先，而其形成可能经历了一次PHA合成酶基因加倍的过程。     

重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的摇瓶发酵条件

研究了重组大肠杆菌E.coli II-1摇瓶发酵生产谷胱甘肽合成酶系的工艺条件,确定了E.coli II-1的最适产酶条件,最佳发酵培养基组成（ g/L)为：葡萄糖10,蛋白胨5,酵母膏2．5,K2HPO4．3H2O 4．0,KH2PO4 1．0,FeCl3 0.2 ,MnCl2.01,CoCl2.01,CaCl20.1,ZnCl2 0.02,H3BO3 0.01,NaMoO4 0.01,NaCl1.0,Na2SeO3 0.02,发酵起始PH7．2,灭菌后加入无菌氨苄青霉素至100ug/mL,每个三角瓶装液量为100毫升,培养前期的温度控制在37度,后期将温度降为35度,拥护档转速200r/min,发酵周期16h,在此条件下,重组大肠杆菌E.coliII-1的谷胱甘肽合成酶系的活性为862．3U／L。     

丙酮酸脱氢酶复合酶系研究进展

对丙酮酸脱氢酶复合酶系的组成、功能及特性进行了简要的综述.丙酸酸脱氢酶系是1个定位在线粒体中的多酶复合体.它是由3种酶:丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3)和调节它的活性的丙酮酸脱氢酶激酶、一种丙酮酸脱氢酶磷酸酶以及功能未知的蛋白X,还有一些辅助因子组成.在能量代谢调控过程中,丙酮酸脱氢酶系是1个主要的酶系.丙酸脱氢酶转化来自于碳水化合物和一些氨基酸的丙酮酸成为乙酰辅酶A.乙酰辅酶A是三羧酸循环的底物.丙酮酸脱氢酶系活性的调节可以通过PDH的磷酸化和脱磷酸化来调节平衡在许多组织中的源于碳水化合物和脂肪酸的乙酰辅酶A.丙酮酸脱氢酶发生突变后而不能行使正常功能,乳酸集结引起乳酸中毒.     

极地微生物产海藻糖合成酶菌株的筛选

来源于极地的微生物经过筛选，得到能产海藻糖合成酶的耐冷菌株S1和S2，分别用TLC、DNS和HPLC的方法确证其酶反应的产物为海藻糖．以质量分数1％麦芽糖为底物，S1粗酶液能将麦芽糖转化为海藻糖，并且没有明显的葡萄糖生成，在pH值7．0的磷酸盐缓冲液下15℃反应48h，经过HPLC测定转化率最高达到75．2％．     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出的Taq DNA聚合酶由于其热稳定性，在聚合酶链式反应(PCR)中得到广泛的应用，我们根据编码Taq DNA聚合酶的基因序列，设计出一对引物，通过PCR扩增出Taq DNA聚合酶基因，并将其克隆到表达载体pET-15b中，转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中实现了大量表达。经过热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA聚合酶。本研究的生产程序可作为Taq DNA聚合酶生产的一种新方法。     

表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性

构建了组成分泌表达载体pUC18ompA,将荧光假单胞菌Pf-5鞭毛蛋白的编码基因fliC克隆到pUC18ompA构建pUC18ompA-fliC,重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建了工程菌。工程菌与无菌松材线虫混合接种黑松无菌苗,研究其对无菌苗的致病能力。接种试验结果表明,工程菌与无菌松材线虫混合接种同样可以引起黑松无菌苗的萎蔫。进一步验证了体内荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松材线虫病致病过程中的作用。     

人APOBEC3G基因克隆、表达、纯化及多克隆抗体制备

为了获得人APOBEC3G蛋白及其多克隆抗体,从H9细胞中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得人APOBEC3G基因.将测序鉴定过的APOBEC3G基因克隆到原核表达载体pET-32a上,以包涵体的形式在E.coli BL21(DE3)中高效表达,由于APOBEC3G蛋白C端融合了6×His标签,有助于对蛋白的纯化及鉴定.应用酶切技术、SDS-PAGE及Western Blot等方法确保基因片段的正确性和蛋白的特异性.纯化后的APOBEC3G蛋白用来免疫日本大耳白兔,用间接ELISA法测定兔多克隆抗体滴度,获得了纯度超过80%的APOBEC3G融合蛋白,抗APOBEC3G多克隆抗体滴度高达1:102 400.     

大肠杆菌中可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21及制备

为在大肠杆菌中高效、非融合、可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF-21),研究了纯化方法,以获得具有较高生物活性的rhFGF-21。全基因合成人成纤维细胞生长因子21cDNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,在转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中进行表达。表达产物经盐析、层析等方法纯化后,利用3T3-L1细胞鉴定其促葡萄糖摄取的生物学活性。结果表明:rhFGF-21在BL21(DE3)PlysS实现了高效、非融合、可溶性表达,目的蛋白占菌体总蛋白的20%左右;表达产物经纯化后,纯度可达95%以上;表达产物能够明显促进3T3-L1细胞对葡萄糖的吸收。该方法成功实现了rhFGF-21在大肠杆菌中高效可溶性表达。     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。