黑松银松素合成酶的cDNA克隆及表达研究

松萎蔫病是由松材线虫引起的一种危害性极大的森林病害,为研究黑松对松材线虫的抗性机制,本文利用RT-PCR技术对黑松体内经转录组分析获得的与银松素合成酶mRNA高相似度的序列进行扩增,获得了银松素合成酶cDNA,然后将此银松素合成酶基因(PSL)克隆到表达载体pET-15b上,构建了重组表达质粒pET-15b-PSL,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)后构建工程菌,通过IPTG诱导,工程菌高效表达重组蛋白,经Ni 2+螯合柱亲和层析得到了纯化重组银松素合成酶。该研究为了解黑松银松素合成酶的功能及松萎蔫病抗性松树的培育奠定了基础。     

表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性

构建了组成分泌表达载体pUC18ompA,将荧光假单胞菌Pf-5鞭毛蛋白的编码基因fliC克隆到pUC18ompA构建pUC18ompA-fliC,重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建了工程菌。工程菌与无菌松材线虫混合接种黑松无菌苗,研究其对无菌苗的致病能力。接种试验结果表明,工程菌与无菌松材线虫混合接种同样可以引起黑松无菌苗的萎蔫。进一步验证了体内荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松材线虫病致病过程中的作用。     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.     

康宁木霉cbh2基因在毕赤酵母中的表达

为拓宽酵母菌的应用领域,构建具有分泌纤维素酶能力的酵母工程菌,利用质粒pPICZαA构建了康宁木霉纤维素酶cbh2基因的酵母表达载体,经线性化后采用电穿孔法转入毕赤氏酵母菌中.以甲醇为诱导物进行诱导,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果证明该基因可成功表达.对重组蛋白进行了产酶活性测定,结果证明该重组蛋白具有纤维二糖水解活性,从而获得了一株可产生纤维素酶的酵母工程菌.     

荧光假单胞菌GcM5-1A重组鞭毛蛋白的表达及其对黑松细胞的毒性研究

针对松萎蔫病的早期诊断及生物防治,本文利用PCR技术从荧光假单胞菌GcM5-1A的基因组中克隆了鞭毛蛋白编码基因fliC,再将该基因克隆到表达载体pET-15b的NcoI和XhoI位点,构建重组质粒pET-15b-fliC,再将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌,IPTG诱导工程菌高效表达C-末端具有多聚组氨酸标签的重组鞭毛蛋白,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经8mol/L尿素溶解,复性并经Ni2+螯合柱亲和层析得到了电泳纯的重组鞭毛蛋白。生测结果表明,重组鞭毛蛋白可引起黑松细胞的大量死亡,与天然鞭毛蛋白对黑松愈伤组织细胞有相似的毒性。该研究为松萎蔫病致病机理的研究奠定了基础。     

小鼠肝脏羧酸酯酶的cDNA克隆、表达及应用

从小鼠肝脏中克隆羧酸酯酶（CES）基因家族成员Ces1f的cDNA,在大肠杆菌中表达,并验证重组酶对农药的作用。采用RT-PCR克隆Ces1f cDNA,与pUCm-T载体连接测序后,亚克隆至表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a-Ces1f,转化到宿主菌BL21（DE3）后经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定,采用Ni柱对表达产物进行纯化并测重组CES的酶比活,利用HPLC验证重组酶对不同农药的作用。结果显示：成功获得纯化的77kDa的重组CES蛋白,其酶液的比活为55.37U/mg,HPLC检测发现重组CES对西维因、呋喃丹及甲基对硫磷等具有降解作用。成功表达重组CES,其对农药具有降解作用,为环境中农药残留的降解奠定了基础。     

人参DS和D12H基因的异源共表达

利用RT-PCR技术和酶切连接技术克隆得到人参皂苷生物合成关键酶DS和D12H基因,并构建出两种基因的表达载体DS-pAUR123和D12H-pAUR123。通过热转化法将两个表达载体转化到酿酒酵母中,得到重组工程菌。两种基因在重组工程菌中能够表达出具有催化功能的活性蛋白质,实现了人参DS和D12H基因的异源共表达。     

β-琼脂糖酶（AgaA7）在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为研究重组β-琼脂糖酶（AgaA7）基因的表达产物及其酶学性质,根据GeneBank中β-琼脂糖酶（AgaA7）基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体pET-22b（＋）中,并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并测定其酶学性质.结果表明：重组酶的相对分子质量为～5.0×10^4,与预期相符.此酶最适反应pH是7.0,在pH58的缓冲液中最稳定;最适反应温度为50℃,在低于50℃时比较稳定.Na^＋,K^＋,Ca^2＋,Mg^2＋对重组酶活性影响不大,而Zn^2＋,Hg^2＋,Pb^2＋则对酶活性具有不可逆抑制作用.     

鼠CCL5蛋白的原核表达与纯化

趋化因子(CCL5)是由正常T细胞分泌的典型的具有趋化活性的细胞因子,分子量8kD,属于CC型趋化因子的β家族成员之一,并调控T淋巴细胞的活性和分泌能力.本研究旨在克隆小鼠趋化因子CCL5基因并在原核表达系统中实现表达,获得与His标签融合的重组趋化因子mCCL5蛋白,并测定其在体外的趋化活性.将趋化因子CCL5基因扩增并插入pET-28a原核表达载体,转化至Rosetta感受态细胞中.重组mCCL5蛋白以IPTG诱导表达,再以Ni-NTA纯化系统进行纯化.Transwell实验检测重组CCL5蛋白的趋化活性.结果显示pET-28a-mCCL5原核表达载体成功构建,mCCL5蛋白在细菌中大量表达并主要以包涵体的形式存在.表达产物以SDS-PAGE和免疫印迹鉴定,Transwell实验证实趋化因子能够显著促进巨噬细胞RAW264.7细胞的迁移.带有His标签重组鼠趋化因子CCL5的成功表达,为下一步CCL5抑制剂的筛选奠定基础.     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出的Taq DNA聚合酶由于其热稳定性，在聚合酶链式反应(PCR)中得到广泛的应用，我们根据编码Taq DNA聚合酶的基因序列，设计出一对引物，通过PCR扩增出Taq DNA聚合酶基因，并将其克隆到表达载体pET-15b中，转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中实现了大量表达。经过热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA聚合酶。本研究的生产程序可作为Taq DNA聚合酶生产的一种新方法。     

大肠杆菌中可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21及制备

为在大肠杆菌中高效、非融合、可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF-21),研究了纯化方法,以获得具有较高生物活性的rhFGF-21。全基因合成人成纤维细胞生长因子21cDNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,在转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中进行表达。表达产物经盐析、层析等方法纯化后,利用3T3-L1细胞鉴定其促葡萄糖摄取的生物学活性。结果表明:rhFGF-21在BL21(DE3)PlysS实现了高效、非融合、可溶性表达,目的蛋白占菌体总蛋白的20%左右;表达产物经纯化后,纯度可达95%以上;表达产物能够明显促进3T3-L1细胞对葡萄糖的吸收。该方法成功实现了rhFGF-21在大肠杆菌中高效可溶性表达。     

噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶相互作用的研究

GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶是噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成代谢中的两个关键酶。本研究将编码GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶的基因crtE和crtB共转化大肠杆菌或将crtE、crtB及编码八氢番茄红素脱氢酶的crtI共转化大肠杆菌,IPTG诱导其表达,然后利用亲和层析、凝胶过滤层析纯化重组蛋白。Western blotting分析结合N-末端序列分析表明,GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶以两种复合体的形式存在,而八氢番茄红素脱氢酶则不能与这两种酶形成稳定的复合体。     

重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达

根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。     

人APOBEC3G基因克隆、表达、纯化及多克隆抗体制备

为了获得人APOBEC3G蛋白及其多克隆抗体,从H9细胞中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得人APOBEC3G基因.将测序鉴定过的APOBEC3G基因克隆到原核表达载体pET-32a上,以包涵体的形式在E.coli BL21(DE3)中高效表达,由于APOBEC3G蛋白C端融合了6×His标签,有助于对蛋白的纯化及鉴定.应用酶切技术、SDS-PAGE及Western Blot等方法确保基因片段的正确性和蛋白的特异性.纯化后的APOBEC3G蛋白用来免疫日本大耳白兔,用间接ELISA法测定兔多克隆抗体滴度,获得了纯度超过80%的APOBEC3G融合蛋白,抗APOBEC3G多克隆抗体滴度高达1:102 400.     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确。电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15ku一致,其表达量占分泌总蛋白的32%。体外抑菌实验证实重组人溶菌酶蛋白对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌均有明显的抑菌作用,表明在毕赤酵母中成功表达了重组人溶菌酶。