携带乙肝表面抗原基因的质粒DNA在小鼠体内的免疫应答

将携带HBsAg基因的质粒DNA,直接注射到小鼠肌肉作为实验组;对照分成2组,一组注射携带β－半乳糖苷酶基因的质粒DNA,另一组注射商品化的血源性乙型肝炎疫苗、4周后从小鼠尾静脉采血,用ELISA方法检测血清中的抗－HBs。结果显示,实验组和注射乙型肝炎疫苗的对照组小鼠血清阳转率分别为5／6和4／6,而注射携带β－半乳糖苷酶的质粒DNA对照组小鼠血清全部为阴性。实验组小鼠血清中抗－HBs的水平与注射乙型肝炎疫苗的对照组小鼠类似,均在免疫后6～16周达到高峰,之后开始下降。抗体持续至少达半年以上。     

HBsAg与GM-CSF基因双表达载体的构建及其免疫效果

目的构建乙型肝炎表面抗原基因(HBsAg)与GM-CSF基因的双表达载体,提高乙肝病毒DNA疫苗的免疫效果。方法将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将HBsAg基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点处,构建双表达载体pHIG。将pHIG转染到COS-7细胞中,检测瞬时表达情况,并用双表达质粒pHIG免疫BALB/c小鼠,检测免疫后小鼠血清中抗-HBs及其脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子的数量。结果在转染pHIG质粒的COS-7细胞上清液中有HBsAg的表达,pHIG双表达质粒组比pVAX/HBs组抗体产生时间提前2周,抗体阳转率提高2倍,小鼠脾脏T细胞表面CD4+分子数量及CD4+/CD8+值均高于pVAX/HBs组。结论HBsAg与GM-CSF基因双表达质粒能引起小鼠特异性免疫应答,并可提高免疫效果。     

在小鼠体内评价环化二核苷酸对乙型肝炎病毒表面抗原免疫作用的影响

目的研究环化二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)在小鼠体内对乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag)免疫作用的影响,探讨其作为疫苗佐剂的可能性。方法以HBs Ag作为模式抗原,评价3种CDN[环二鸟苷酸(c-di-GMP)、环二腺苷酸(c-di-AMP)和环鸟苷酸-腺苷酸(c GAMP)]在小鼠中对HBs Ag免疫作用的影响。经肌肉注射时以铝佐剂作为对照,经黏膜免疫时以壳聚糖(chitosan,CTS)作为对照,ELISA法测定各组小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗体(HBs Ab)水平。同时将c-di-GMP与CTS联合进行黏膜免疫,ELISA法测定各组小鼠血清中的HBs Ab水平,ELISPOT法检测小鼠脾细胞特异性细胞因子分泌水平。结果 3种CDN+HBs Ag经肌肉免疫诱导产生的HBs Ab水平均明显高于HBs Ag单独免疫组(P0.001),且3组CDN+HBs Ag组与铝佐剂+HBs Ag组差异无统计学意义(P0.05)。c-di-GMP+HBs Ag经黏膜免疫诱导HBs Ab水平明显高于HBs Ag单独免疫组,且与CTS+HBs Ag组比较,差异无统计学意义(P0.05)。c-di-GMP与CTS联合黏膜免疫诱导的HBs Ab水平与c-di-GMP+HBs Ag组及CTS+HBs Ag组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 3种CDN均具有一定的免疫增强作用,肌肉注射效果与铝佐剂相当;c-di-GMP黏膜免疫效果与CTS相当,c-di-GMP与CTS联合黏膜免疫未显示有协同免疫增强作用。提示CDN具有进一步开发成疫苗佐剂的潜力。     

载多烯紫杉醇的靶向脂质超声微泡联合超声靶向微泡破裂技术对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨载多烯紫杉醇(docetaxel,DTX)的靶向脂质超声微泡(DR5-DLLM)联合超声靶向微泡破裂技术(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)对人肝癌Hep G2细胞增殖及凋亡的影响。方法采用机械振荡法、生物素-亲和素连结法分别制备包载DTX的脂质超声微泡(DLLM)和DR5-DLLM。MTT法检测DTX对人肝癌Hep G2细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC50)。将体外培养人肝癌Hep G2细胞分为空白对照组、DTX组、DTX+UTMD组、DLLM+UTMD组及DR5-DLLM+UTMD组,按IC50的药物浓度进行给药,UTMD以0.5 W/cm2的超声声强辐照45 s。CCK-8法检测细胞毒性作用,TUNEL法检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞周期。结果 DTX可有效抑制人肝癌Hep G2细胞增殖,且呈时间-剂量效应关系。与其他组比较,DR5-DLLM+UTMD组细胞毒性明显增强(P0.001);细胞凋亡率明显升高(P0.001);G2/M期细胞明显增多、S期细胞明显减少(P0.001)。结论DR5-DLLM联合UTMD可增强对人肝癌Hep G2细胞增殖抑制、细胞周期阻滞和凋亡诱导作用,该方法有望成为肝癌分子靶向治疗的一种新途径。     

干扰素α2a与白细胞介素-2联合作用对体外HepG2.2.15细胞增殖及乙型肝炎病毒复制的影响

目的探讨干扰素α2a(interferonα2a,IFNα2a)与白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)联合作用对体外肝癌细胞HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响。方法用不同浓度的IFNα2a(5 000、10 000、15 000 IU/ml)和IL-2(2 500、5 000、10 000 IU/ml)单独及联合作用HepG2.2.15细胞96 h后,采用WST-1法检测细胞增殖情况,倒置相差显微镜观察联合作用组细胞形态学变化,ELISA法检测联合作用组细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达,斑点杂交法检测联合作用组细胞HBV-DNA的复制情况。结果与不同浓度的IFNα2a和IL-2单独作用相比,二者联合作用对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用明显增强(P<0.05);IFNα2a与IL-2联合作用组HepG2.2.15细胞显微镜下可见细胞逐渐变圆,胞浆中颗粒增多,增殖变慢,细胞间接触不紧密,细胞周围碎片增多;联合作用组细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达明显受到抑制(P<0.05);5 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2、10 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2和15 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2对HepG2.2.15细胞HBV-DNA的复制有抑制作用。结论 IFNα2a与IL-2联合作用对HepG 2.2.15细胞增殖及HBV-DNA复制均有抑制作用。本实验为后续体内动物实验及筛选合适的疫苗佐剂奠定了基础,也为新型乙型肝炎疫苗及治疗性乙型肝炎疫苗的研究提供了参考。     

阳离子脂质体DOTAP作为乙肝疫苗佐剂的免疫增强效果

目的探讨阳离子脂质体DOTAP(2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵)作为乙肝疫苗佐剂的免疫增强效果。方法薄膜蒸发复水法制备DOTAP阳离子脂质体乙肝疫苗,检测其粒径、Zata电位、包封率;将BALB/c小鼠随机分为5组:DOTAP阳离子脂质体乙肝疫苗组(DOTAP佐剂组)、不加佐剂的乙肝疫苗组(HBS组)、乙肝疫苗加铝佐剂组(铝佐剂组)、乙肝疫苗加CPG-ODN佐剂组(CPG-ODN佐剂组)以及PBS对照组,免疫剂量分别为0.2、2μg/(只·0.1ml),每个剂量10只小鼠,分别于0、28d经肌肉免疫,0、14、28、42d采血,分离血清,ELISA法检测血清中抗HBs特异性IgG抗体、亚型抗体(IgG1、IgG2a)滴度。结果制备的阳离子脂质体乙肝疫苗平均粒径200~300nm,粒径分布均匀,带正电荷,包封率在70%以上。DOTAP佐剂组血清IgG抗体水平明显高于HBS组,其中2μg剂量组差异有统计学意义(P0.05);与铝佐剂组相比,两个剂量组差异均无统计学意义(P0.05);0.2μg剂量组显著低于CPG-ODN佐剂组(P0.05)。DOTAP佐剂组可同时诱导高水平的IgG1、IgG2a型抗体,两个剂量组产生的IgG1型抗体水平均与铝佐剂组相当(P0.05),但IgG2a型抗体滴度均明显高于铝佐剂组(P0.05);两个剂量DOTAP佐剂组产生的IgG1、IgG2a型抗体水平与CpG-ODN佐剂组相比,差异均无统计学意义(P0.05)。结论DOTAP阳离子脂质体作为重组乙肝疫苗的佐剂具有良好的免疫增强效果,其对体液免疫的增强作用不劣于铝佐剂和CPG-ODN佐剂,DOTAP佐剂可同时诱导Th2细胞和Th1细胞介导的免疫应答。     

CpG-ODN对乙肝核酸疫苗及重组疫苗免疫效果的影响

目的研究CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)对乙肝核酸疫苗及重组(CHO细胞)疫苗免疫效果的影响。方法核酸疫苗实验组用CpGODN与乙肝核酸疫苗联合免疫BALBc小鼠,阳性对照组注射核酸疫苗,阴性对照组注射质粒pVAX1;重组疫苗分4个实验组,用CpGODN与不同剂量的重组疫苗配伍后分别免疫BALBc小鼠,阳性对照组注射重组疫苗,阴性对照组注射生理盐水。应用ELISA检测小鼠血清中的抗HBs水平。结果CpG与乙肝核酸疫苗组抗体阳转率比阳性对照组提高3倍,抗体水平提高2倍。CpG与重组疫苗组的阳转率和阳转时间均高于或早于CpG与核酸疫苗实验组。加入CpGODN后,即使重组疫苗用量减少3倍,诱导抗体水平和阳转率均无明显改变。结论CpGODN可提高乙肝核酸疫苗和重组疫苗的免疫效果,并使抗体产生的时间提前。     

含preS2免疫表位乙型肝炎表面抗原DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答

目的　探讨含preS2免疫表位基因质粒DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答。方法　质粒转染COS 7细胞 ,用ELISA法测定瞬时表达产物。质粒经碱裂解法大量提取 ,Sepharose 4FF柱层析纯化后 ,直接肌肉注射免疫NIH小鼠。检测小鼠的体液免疫和细胞免疫应答效果。结果　preS2表位多肽和HBsAg高效表达。免疫小鼠血清中检测到高滴度的抗 HBs和抗 preS2。淋转刺激指数SI和IL 2活性 ,质粒DNA疫苗与单纯主蛋白疫苗免疫对照组比较 ,差异有显著意义。结论　含preS2免疫表位基因质粒DNA疫苗能诱导NIH小鼠产生较强的体液免疫和一定强度的细胞免疫应答     

重组乙型肝炎病毒核心抗原的免疫原性及其对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫增强作用

目的探讨重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的免疫原性及其对重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增强作用。方法用透射电镜观察HBcAg、HBsAg及HBcAg+HBsAg混合抗原病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的形态。将小鼠随机分为6组:阴性对照组(NS)、HBcAg组(C)、HBsAg组(S)、HBsAg+铝佐剂组(S+Al)、HBsAg+HBcAg混合组(S+C)及HBsAg+HBcAg+铝佐剂组(S+C+Al),用相应抗原免疫各组小鼠,分别于第0天、第14天经小鼠双侧大腿肌肉进行初次和加强免疫1次,间接ELISA法检测各组小鼠血清中HBsAg和HBcAg的特异性抗体水平,分析HBsAg特异性抗体亚类,ELISPOT法检测各组小鼠脾细胞中HBsAg特异性IFNγ、HBcAg特异性IFNγ及HBsAg特异性IL-4水平。结果电镜观察可见HBsAg和HBcAg均呈大小均一的VLP结构,二者混合后有聚集现象。初次免疫后,S+C组的HBsAg特异性抗体水平与S组差异无统计学意义(P=0.074),加强免疫后,S+C组HBsAg特异性抗体水平明显高于S组(P=0.002),C组和S+C组均可产生高水平HBcAg特异性抗体。S组HBsAg抗体亚类以IgG1为主,S+C组以IgG2a为主。S+C组HBsAg特异性IFNγ斑点数明显高于S组、S+Al组和S+C+Al组(P<0.05),C组与S+C组HBcAg特异性IFNγ斑点数均较高,与S+C+Al组比较,S+Al组HBsAg特异性IL-4斑点数明显升高(P=0.026)。结论 HBcAg具有良好的免疫原性,可增强HBsAg的免疫反应,使反应向Th1方向极化,为治疗性乙肝疫苗的研发奠定了基础。     

蛋白对HCV/HBV DNA疫苗的免疫增强作用

目的探讨蛋白对HCV/HBV DNA疫苗的免疫增强作用。方法将构建的HCV/HBV真核表达载体pcDNA-PCXS和蛋白分别免疫BALB/c小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCV Ab;3H-TdR掺入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;51Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTLs杀伤作用。结果DNA-蛋白组抗-HBs和抗-HCV抗体均较DNA组出现早,且抗体水平明显高,DNA-蛋白组的CTL应答水平也明显高于DNA组。结论蛋白能提高DNA疫苗的特异性体液和细胞免疫功能,为DNA疫苗的实际应用提供了一种新的策略。     

不同乙型肝炎表面抗原配制的免疫复合物的免疫原性

目的研究不同乙型肝炎表面抗原配制的免疫复合物(IC)的免疫原性,并进一步优选治疗性乙型肝炎疫苗最佳抗原。方法用不同重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与不同的乙型肝炎表面抗体(anti-HBs)制备IC,分别免疫BALB/c小鼠,检测体液免疫及细胞免疫应答水平。结果IC诱生的抗-HBs效价、抗-HBsIgG2a/IgG1的比值及IFN-γ形成细胞数,YHB-IC组总体上略高于CHO-IC组,但差异无显著意义。结论IC的免疫效果优于单独HBsAg;不同乙型肝炎表面抗原配制的IC之间免疫原性差异无显著意义。     

CpG ODN2006对乙型肝炎疫苗免疫BALB/c小鼠抗体产生的影响

目的探讨合成含CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpGODN2006)对乙型肝炎疫苗增强小鼠特异性抗体产生的效应。方法采用BALB/c小鼠,经后腿胫骨前肌注免疫2次,ELISA法检测血清中抗HBsIgG效价。结果疫苗+CpG组较疫苗组和空白对照组的抗HBsIgG效价明显增高,且维持时间长。结论CpGODN2006对小鼠抗HBsIgG的产生具有明显的增强作用。     

白细胞介素-2基因佐剂对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响

目的研究白细胞介素-2基因佐剂对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响。方法利用分子生物学技术构建含IL-2基因的重组质粒pcDNA3.1/IL-2,经测序鉴定、碱裂解法大量提取及Sepharose4FF柱层析纯化,得到重组质粒pcDNA3.1/IL-2和pcDNA3.1/S,免疫豚鼠后,经ELISA检测豚鼠血清中抗HBsAg滴度,CTLL-2细胞株/MTT法检测IL-2活性。结果序列测定和分析结果表明重组质粒pcDNA3.1/IL-2构建正确。血清中抗HBsAg抗体滴度:铝佐剂+HBsAg组为2116mIU;IL-2+HBsAg组为1987mIU;质粒pcDNA3.1/IL-2+HBsAg组为2252mIU;质粒pcDNA3.1+IL-2+pcDNA3.1/S组为67·19mIU;质粒pcDNA3.1/S组为50·88mIU。重组质粒pcDNA3.1/IL-2免疫1周后,IL-2表达水平达高峰,以后逐渐降低,但1个月后IL-2水平仍高于空白对照组。对抗HBsAg抗体滴度和IL-2活性的检测结果进行统计学分析表明,各组间差异有显著意义(P<0·05)。结论IL-2基因佐剂可以增强乙肝重组疫苗和乙肝DNA疫苗的免疫效果。     

成人乙型肝炎疫苗多次免疫无应答者再接种甲乙型肝炎联合疫苗的免疫效果

目的探讨成人乙型肝炎疫苗免疫对策。方法对多次免疫后抗-HBs仍为阴性的228名研究对象接种甲乙型肝炎联合疫苗,按0、1、6个月20μg×3免疫程序进行免疫,于210d抽血,采用放射免疫法进行抗-HBs检测。结果228名乙型肝炎疫苗多次免疫无应答者,接种甲乙型肝炎联合疫苗后,抗-HBs阳性172名,阳转率75.44%,抗体几何平均滴度(GMT)为197.20m IU/ml。结论对成人乙型肝炎疫苗多次免疫无应答者,增加接种剂量或接种甲乙型肝炎联合疫苗,可提高抗-HBs阳转率。     

重组HBcAg与HBsAg混合抗原的免疫效果

目的观察重组HBcAg与HBsAg混合抗原免疫BALB/c小鼠后体液免疫与细胞免疫的效果。方法配制含Al(OH)3佐剂与不含佐剂的混合抗原,分别免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法测定抗体滴度和细胞因子水平;采用流式细胞仪分析T细胞亚群。结果HBcAg与HBsAg混合抗原免疫小鼠产生的IFN-γ量明显高于二者单独免疫,CD3+和CD4+水平显著增高;含Al(OH)3佐剂的混合抗原CD8+水平明显高于阴性对照组;混合抗原免疫小鼠血清产生的抗-HBs抗体与2倍剂量的HBsAg单独免疫相比,差异无显著意义。含Al(OH)3佐剂与不含佐剂的疫苗免疫效果差异无显著意义。结论重组HBcAg与HBsAg混合抗原表现出良好的体液免疫与细胞免疫效果,为治疗性乙肝疫苗的开发提供了依据。     

乙型肝炎表面抗原联合rmIL-12诱导的小鼠细胞免疫应答

目的探讨乙型肝炎表面抗原(HBsAg)联合重组鼠白介素-12(rmIL-12)对免疫小鼠诱导细胞免疫应答的影响。方法以不同给药方式、不同剂量的HBsAg联合rmIL-12免疫C57BL/6J小鼠,ELISA法检测小鼠血清及脾淋巴细胞中IFNγ及IL-4的水平。结果HBsAg+rmIL-12高剂量组免疫的C57BL/6J小鼠,其脾淋巴细胞IFNγ水平明显高于BALB/c小鼠;3种不同给药方式均可诱导C57BL/6J小鼠血清和脾细胞IFNγ水平明显升高,三者之间差异无统计学意义;HBsAg+rmIL-12高、中、低剂量组免疫C57BL/6J小鼠血清可诱导IFNγ水平明显升高,且呈剂量依赖性,脾细胞IFNγ水平在中、低剂量组均未产生效应,高剂量组明显升高,而对IL-4无明显影响。结论rmIL-12可显著增强HBsAg诱导的细胞免疫应答,并使免疫应答转向Th1型,对于发展治疗性乙肝疫苗具有潜在的应用价值。     

含IL-2基因的乙型肝炎病毒DNA疫苗的构建及其免疫效果

目的构建含白细胞介素-2(IL-2)基因的乙型肝炎病毒DNA疫苗,并考察免疫效果。方法将微小病毒内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site,IRES)基因克隆到质粒pVAX1载体多克隆位点处,再将乙肝病毒表面抗原(HB-sAg)基因和IL-2基因分别连接在IRES基因的两侧,构建出乙肝病毒DNA疫苗pHII。将pHII转染COS-7细胞,进行瞬时表达。大量提取质粒后,按0、2、4周程序免疫BALB/c小鼠,以pVAX1质粒为阴性对照,pVAX/HBsAg质粒为阳性对照。第1针免疫1周后开始眼眶采血,检测血清中HBsAg和HBsAb含量。第1针免疫13周后处死小鼠,用流式细胞仪检测其脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子数量。结果在转染pHII质粒的COS-7细胞上清液中检测到HBsAg和IL-2的表达。实验组和阳性对照组小鼠分别于第1针免疫2、4周后,在血清中检测出HBsAb,但阴性对照组未测出。以上3组均未检测出HBsAg。实验组与阳性对照组相比,产生抗体的时间提前2周,抗体阳转率提高2.5倍,产生抗体的量也提高了近3倍。实验组CD4+分子数量和CD4+/CD8+值均高于阳性对照组。结论乙肝病毒DNA疫苗pHII成功诱导出小鼠的免疫应答,其免疫效果明显优于不含分子佐剂的乙肝DNA疫苗。