基于IRES序列的多基因共表达载体构建

目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和HeLa两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白质免疫印迹实验表明,DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组,并且两种蛋白质表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白质相互作用及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。     

糖尿病心肌病代谢重构的分子机制

糖尿病心肌病(diabete cardiomyopathy,DBCM)首先本质上是心脏的代谢性疾病,无论1型糖尿病或2型糖尿病均能引起高糖血症、高脂血症、高胰岛素血症和高廋素血症等代谢紊乱,为了应对这些代谢失常心脏在代谢底物利用和能量生成发生适应性和代偿性直至失代偿性改变,亦即心脏的代谢重构(亦称代谢重编程,metabolic remodeling,metabolic reprogramming),具体而言就是:糖尿病环境下,心肌细胞葡萄糖摄取减少、糖酵解和葡萄糖氧化降低,另一方面,心肌细胞游离脂肪酸(free fat acid,FFA)吸收增加、β氧化提高,随之而来的是细胞能量代谢效率降低,伴随耗氧增加和活性氧(reactive oxygen species,ROS),若超过内源性抗氧化能力,此即氧化应激(oxidative stress),进而导致心肌细胞死亡和间质纤维化。糖尿病心脏代谢重构主要是由葡萄糖和脂肪酸摄取和氧化代谢的蛋白与酶介导,而这些蛋白的表达受PPAR-α、PPAR-β等核转录因子的调控,提示PPARs活性与表达改变是心脏代谢重构的重要分子机制。     

抑制miR181b通过上调PKG-1减轻大鼠心肌细胞肥大

目的:通过检测miR181b在心肌肥厚患者外周血中的表达,研究miR181b与PRKG-1在心肌肥大中的作用机制,为心肌肥厚临床诊断和治疗提供新的靶点。方法:采用实时定量PCR方法检测50例临床诊断为心肌肥厚患者及25例正常健康人的外周血miR181b的水平,分析其表达水平与临床病理特征的关系。结果:miR181b在心肌肥厚患者外周血中表达(3.35±0.22)升高,差异有统计学意义(P<0.05);体外大鼠原代心肌细胞在镜下呈多角形,采用α-横纹肌肌动蛋白抗体和DAPI进行免疫荧光染色,镜下90%以上细胞发出绿色荧光,表明原代培养心肌细胞纯度较高;采用去氧肾上腺素处理心肌细胞72 h后,心肌细胞总蛋白表达显著升高(P<0.05);流式细胞术结果显示PE组心肌细胞大小明显增加(P<0.05);实时定量PCR检测结果表明,PE组中心肌肥大相关基因β-MHC、α-SA、ANP显著升高(P<0.05),证明体外构建心肌肥大模型成功。结论:miR181b在心肌肥厚患者外周血中表达显著上调;体外成功培养乳鼠原代心肌细胞,通过PE处理法成功构建体外心肌肥大模型;在肥大心肌细胞中,miR181b与prkg-1 m RNA及蛋白的表达有显著相关性;miR181b可能通过调控prkg-1 m RNA及蛋白水平的表达参与心肌肥大,有望成为心肌肥厚临床诊断和治疗的新的靶点。     

成年小鼠心脏单个细胞悬液的制备及流式细胞检测

目的:制备成年小鼠心脏单细胞悬液,测定心肌缺血再灌注损伤(reperfusion injury,RI)小鼠心肌中白细胞的分布情况。方法:选取10~12周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠15只,按照随机方法将其分为假手术组5只(模型制备成功5只)和RI 24 h组10只(模型制备成功7只)。RI 24 h组小鼠心脏缺血30 min后,于再灌注24 h后摘取小鼠心脏,配置心脏消化液,冲洗剪碎进行消化,经过滤离心收集心脏细胞,行流式细胞检测,以CD45标记白细胞,并进一步行CD11c标记树突状细胞及Ly6C标记单核细胞。比较两组CD45阳性细胞比例及CD11c、Ly6C标记的细胞占CD45阳性细胞比例;比较两组各细胞在总心肌细胞中的比例。结果:每只小鼠心脏制备所得的单个细胞悬液行细胞计数为(1~2)×10~6个。RI 24 h组CD45阳性细胞占心肌细胞比例高于假手术组(P<0.05);RI 24 h组CD11c~+Ly6C~+树突状细胞占CD45阳性细胞的比例高于假手术组(P<0.05)。RI 24 h组CD11c标记的树突状细胞及Ly6C标记的单核细胞等各亚群细胞在总心肌细胞中的比例均高于假手术组(P<0.05)。结论:成年小鼠心脏细胞的单细胞悬液可以通过切碎和消化制备,可用单细胞悬液流式细胞仪检测RI心肌白细胞、树突状细胞和单核细胞的显著变化。本研究为小鼠心脏白细胞的详细分析提供了一种可行的方法。     

锌指E盒结合蛋白1在骨发育和骨肿瘤发生中的作用

锌指E盒结合蛋白1(Zeb 1)为Zeb基因家族一员,是胚胎发育、细胞分化、肿瘤发生等生理病理过程必不可少的转录因子;有实验证据表明Zeb 1与骨发育和骨肿瘤发生发展密切相关。本文结合Zeb 1结构和功能,从生理性骨发育和病理性恶性骨肿瘤发生发展的角度系统论述Zeb 1相关调控机制,并做进一步的研究展望。     

原癌基因c-Myc的生物学功能及在卵泡发育中的作用

Myc原癌基因家族包括3个相关基因：c-Myc,n-Myc,l-Myc。c-Myc属核转录因子类原癌基因,其编码的蛋白质在核内结合于DNA链上,对转录过程实施调控。c-Myc诱导化的形式为基因的大量扩增,它影响细胞增殖、转化需要通过其他基因和旁路系统,有直接调节其他基因的转录作用[1]。     

基于重组毕赤酵母的fusaruside生物合成

目的:构建产fusaruside的毕赤酵母菌株,解决天然小分子免疫抑制剂fusaruside的来源问题。方法:从禾谷镰刀菌Fusarium graminearum PH-1中扩增获得合成fusaruside的相关基因-3位去饱和酶[Δ3(E)-SD]和10位去饱和酶[Δ10(E)-SD]基因;并通过2A肽策略构建两种基因的共表达载体,转化到毕赤酵母GS115中进行双酶的诱导表达;对诱导后的毕赤酵母菌体进行甲醇和二氯甲烷的处理后,经高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)检测其中产物变化。结果:3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中成功共表达,SDS-PAGE显示3位去饱和酶分子量约为48kDa,10位去饱和酶分子量约为65kDa; HPLC-MS显示重组酵母可以产生fusaruside。结论:与fusaruside原产菌株镰刀菌相比,该酵母菌的发酵时间更短、产量更高,为fusaruside的进一步开发与应用奠定基础。     

基于网络药理学探索芪甲扶正方治疗非小细胞肺癌的分子机制

目的:基于网络药理学研究芪甲扶正方治疗非小细胞肺癌的潜在分子机制。方法:利用TCMSP、Swiss Target Prediction等数据库筛选芪甲扶正方中药物的成分,并进行靶点预测,通过TCGA、TTD、CTD等数据库筛选非小细胞肺癌相关靶点,构建疾病模型。获得共有靶点后,构建"药物-靶点"映射网络,并通过网络拓扑分析方法筛选关键靶点,进行GO富集和KEGG通路分析。结果:本研究共预测得到106个芪甲扶正方治疗非小细胞肺癌的潜在靶点,利用网络拓扑分析筛选得到20个关键靶点。根据关键靶点GO富集分析和KEGG通路注释结果,芪甲扶正方可能具有调节一氧化氮合酶活性、细胞外基质降解、细胞周期蛋白结合、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶活性等分子功能,其作用通路与膀胱癌、雌激素信号转导、VEGF信号、非小细胞肺癌、IL-17信号转导等通路相关。结论:芪甲扶正方通过多靶点作用于非小细胞肺癌,其主要机制与调节一氧化氮合酶活性、细胞周期、细胞外基质降解等生物学过程,并可影响多条癌症相关通路。     

利用双启动子载体构建产异丁醇大肠杆菌

为了实现异丁醇代谢途径中关键酶的高效共表达,选择具有双T7启动子的质粒载体pCDFDuet、pRSFDuet和pACYCDuet,将基因kivd和alsS分别克隆至pCDFDuet的两个启动子下,yqhD和ilvCD分别克隆至pRSFDuet或pACYCDuet的两个启动子下,构建成两种双质粒共表达系统,获得产异丁醇重组大肠杆菌Eco(CDF+RSF)和Eco(CDF+ACYC)。其中重组菌Eco(CDF+RSF)发酵产异丁醇达2.7g/L;而重组菌Eco(CDF+ACYC)产异丁醇能力较强,达3.5g/L。对两种重组菌目标蛋白的表达量及活力进行比较分析,发现重组菌Eco(CDF+ACYC)中实现了关键酶AHAS(alsS基因编码)和KDCA(kivd基因编码)的高效表达,对提高异丁醇的产量有重要的影响。利用双启动子载体成功构建了具有较高产异丁醇能力的重组菌Eco(CDF+ACYC),为后续改造以适应工业化生产打下了较好的基础。