重组仿刺参超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达条件的优化及分离纯化

利用基因工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)-SOD1,优化表达重组仿刺参超氧化物歧化酶蛋白(rAj-SOD1)。采用摇瓶发酵优化rAj-SOD1可溶性表达的条件,提高蛋白的表达产量。结果表明,在温度30℃、转速200 r/min、0.1 mmol/L IPTG诱导8 h条件下,菌体中rAj-SOD1蛋白表达量最大,达到315.59 mg/L。电泳检测结果表明,rAj-SOD1的纯度为96.7%,符合后续酶活要求。纯化后rAj-SOD1质量浓度为98.73 mg/L,收率为31.28%。邻苯三酚法对rAj-SOD1蛋白进行活性分析,结果表明,纯化的rAj-SOD1蛋白具有明显的抗氧化活性。     

重组海参溶菌酶的表达及其性质

研究了重组海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)可溶性表达的发酵条件。采用多因素正交优选法,以摇瓶培养方式从培养基组分、发酵条件两个方面对重组海参溶菌酶进行研究,构建了高效分泌型表达重组海参溶菌酶工程菌。研究结果发现,30℃、140r/min、IPTG浓度0.3mmol/L、诱导后继续培养14h,目的蛋白分泌表达量可达到30~40mg/L,且产物以大量可溶性蛋白存在。     

仿刺参过氧化氢酶的克隆、表达及纯化

采用RT-PCR技术从仿刺参肠道组织中克隆了过氧化氢酶(Aj-CAT)蛋白的编码序列(CDS)。通过PCR扩增,成功构建了含有Aj-CAT编码序列的重组表达载体pET28c-Aj-CAT。通过热激法获得用于外源表达仿刺参过氧化氢酶蛋白的基因工程菌株BL21(DE3)/pET28c-Aj-CAT。IPTG诱导后,SDS-PAGE检测发现,基因工程菌能够在体外成功地表达融溶状态的仿刺参过氧化氢酶蛋白。利用镍离子亲和层析柱分离纯化,经200 mmol/L咪唑洗脱后,成功得到纯度为97.6%、能够清除过氧化氢的Aj-CAT蛋白。     

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中的表达

从黑曲霉eDNA文库中筛选出糖化酶基因,并在酿酒酵母中进行表达．阳性克隆在发酵培养基中培养60h后,产生的糖化酶酶活力达到峰值为4．3U／mL．测定结果显示其糖化酶大小为1908bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质．酶学性质分析显示该酶的最适反应温度为50℃,pH为5．0．经柱分离纯化其发酵上清液后,SDS-PAGE电泳方法,测得它的分子量大约为70kD,且条带清晰．     

仿刺参过氧化氢酶的理化性质

利用重组工程菌BL21(DE3)/pET-28c-Aj-CAT外源表达了具有抗氧化活性的重组仿刺参过氧化氢酶(rAj-CAT)。重组rAj-CAT在405 nm处具有一个特征峰谱,且该峰谱不受Na₂S₂O₄的影响。典型的过氧化氢酶抑制剂如3-氨基-1,2,4-三唑、盐酸羟胺和叠氮化钠对rAj-CAT具有显著抑制作用。结果表明,此海参种属的过氧化氢酶属于典型的单功能过氧化氢酶。对重组rAj-CAT蛋白的最适酶活条件进行检测,确定rAj-CAT在较低温度范围(4～30℃)都具有降解H₂O₂的作用,最适酶活温度为10℃;rAj-CAT具有较宽的pH耐受范围,在pH 4.0～11.0都具有催化活性;rAj-CAT也能耐受多种金属离子和化学物质,包括Triton X-100、吐温20和EDTA;但DTT、β-ME、SDS、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶对rAj-CAT水解H₂O₂的活性具有较强的破坏作用。结果表明,海参种属的Aj-CAT是一种能够在较低...     

重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达

根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。     

仿刺参体表微生物的菌相分析

采用3种培养基对大连仿刺参体表微生物进行分离,并通过细菌形态、生理生化特性和16SrD-NA分子生物学相结合的方法对分离纯化的细菌进行鉴定,从而了解大连仿刺参体表的菌群组成。结果表明,从仿刺参体表分离纯化了105株细菌,鉴定出10种不同的菌属分别为交替假单胞菌属(Pseud-oalteromonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),变形菌属(Proteobacterium)、Alteromonadacea、不动杆菌属(Acinetobacter)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens),腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus),其中交替假单胞菌属和弧菌属分别占分离菌株的23.8%和22.9%。     

大连海湾仿刺参肠道细菌多样性的16S rDNA分析

采用构建16SrDNA克隆文库的方法对大连湾仿刺参肠道中的细菌进行了多样性研究,NCBI数据库中序列的Blast比对结果表明,大连湾仿刺参肠道细菌具有高度多样性。挑取149个阳性克隆子,经HinfⅠ和HaeⅢ限制性内切酶谱型分析后得到36个可操作分类单元(OTUs)进行序列测定,克隆文库库容覆盖率为75.8%,结果是大连湾仿刺参肠道细菌分属于14种(属),主要为弧菌(Vibiro),优势菌群为Proteobacteria,占86.1%。用CLUSTAL X软件对36个OTUs序列和NCBI基因库中最相似的序列进行分析,应用MEGA 4软件中neighbor-joining方法构建系统发育树,确定大连湾仿刺参肠道细菌与已知菌之间基因系统进化关系。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

非融合海参溶菌酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶活鉴定

利用实验室已构建好的表达载体pET32a(+)-SjLys,在基因工程菌RoSetta(DE3)plysS中表达重组融合海参溶菌酶rSjLys。利用融合的组氨酸标签,通过Ni 2+-NTA层析柱分离、纯化,获得高纯度的重组海参溶菌酶。利用重组牛肠激酶在22℃、pH 7.4、16h条件下对目的蛋白rSjLys的融合标签Trx-His-S tag进行完全酶切,通过Ni 2+-NTA层析柱纯化得到纯度大于99%的非融合的海参溶菌酶SjLys。实验结果表明,作为i型溶菌酶,与rSjLys比较,非融合海参溶菌酶对指示菌溶壁微球菌具有明显的抑菌作用。     

重组中国明对虾溶菌酶包涵体的复性研究

作者的前期研究已证明,大肠杆菌表达系统能够高效表达重组中国明对虾溶菌酶,但目的蛋白主要以包涵体形式存在。本实验研究了重组中国明对虾溶菌酶包涵体的变性条件,并分别采用稀释复性法和亲和层析复性法对包涵体进行处理。实验结果发现,亲和层析复性明显优于稀释复性,具有更高的蛋白复性产率。在亲和层析复性实验中,分别优化了上样量、pH和温度3种因素。结果表明,较低浓度的蛋白复性液在pH 8.0的缓冲体系下,降低上样量并提高环境温度,会有效提高复性效率。亲和层析复性得到高纯度、可溶的重组对虾溶菌酶蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌均具有高效的抑菌活性。     

酿酒酵母原生质体菌株的筛选

实验研究酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) 原生质体的分离再生及再生菌株的构建 ,以蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶的去壁效果最好 ,而新生酶、几丁质酶的去壁效果较差。 2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。酶解液浓度在 0 .1 %～ 2 %内原生质体释放量随酶解液的浓度升高而上升。酶解液 pH值在 5 .0～ 7.0时原生质体的产量较高 ,渗透压稳定剂以柠檬酸 -磷酸缓冲液( pH6.0 ,内含 0 .8mol/L山梨糖醇 )处理原生质体释放量最高。而培养基对原生质体释放量的影响不明显。通过原生质体融合技术 ,获得融合子HG112 ,对HG112 进行以葡萄糖为基质的发酵试验 ,结果显示该融合子乙醇含量达 7.9% (体积比 ) ,比亲本QT提高 4 9.7% ,该技术可用于筛选优良菌株     

酿酒酵母原生质体菌株的筛选

实验研究酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）原生质体的分离再生及再生菌株的构建，以蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶的去壁效果最好，而新生酶、几丁质酶的去壁效果较差。2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。酶解液浓度在0.1％－2％内原生质体释放量随酶解液的浓度升高而上升。酶解液pH值在5.0－7.0时原生质体的产量较高，渗透压稳定剂以柠檬酸－磷酸缓冲液（pH6.0，内含0.8mol/L山梨糖醇）处理原生质体释放量最高。而培养基对原生质体释放量的影响不明显。通过原生质体融合技术，获得融合子HG112，对HG112进行以葡萄糖为基质的发酵试验，结果显示该融合子乙醇含量达7.9％（体积比），比亲本QT提高49.7％，该技术可用于筛选优良菌株。     

瑞氏木霉木聚糖酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及在酵母中的表达

本实验从构建于大肠杆菌DH5α的瑞氏木霉cDNA文库中用PCR法体外扩增到木聚糖酶I（XynI)的DNA片段，然后连接至穿梭载体pAJ401,转化酵母H158,以刚果红染色法筛选阳性重组子并测序，当将其mRNA5‘端非翻译区的79个碱基删除后，木聚糖酶的表达水平显著提高，有可能此基因的调节区位于5‘端非翻译区内，而且可能被酵母的相关基因表达因子所识别。     

酿酒酵母糖酵解途径的动态模拟

利用葡萄糖脉冲对酿酒酵母厌氧连续培养物施加扰动,通过不同时间点取样,定量细胞内外主要化合物的含量。利用测定的数据和细胞内糖酵解途径模型进行各反应途径的参数估计,结果发现实际测量值与预测值接近。代谢控制分析发现,糖酵解途径中,磷酸果糖激酶、己糖激酶和己糖转运系统具有较大的通量控制系数。随机改变细胞内外化合物的浓度对细胞能荷状态的模拟结果显示,酿酒酵母能在1min内将细胞的能荷状态恢复到初始水平。     

响应面法优化微波提取酿酒酵母中谷胱甘肽条件的研究

利用响应分析法考察了微波处理时间、提取时间和水料比3个因素对微波提取酿酒酵母胞内谷胱甘肽提取率的影响。研究发现,谷胱甘肽的最佳提取条件为：微波处理20．96s、提取时间为13．25min,加水量与干细胞的比为22．20mL／g,谷胱甘肽的提取率为13．06mg／g,比单因素试验最高的提取率高8．3％,且与预期值相符。     

响应面法优化微波提取酿酒酵母中谷胱甘肽条件的研究

利用响应分析法考察了微波处理时间、提取时间和水料比3个因素对微波提取酿酒酵母胞内谷胱甘肽提取率的影响。研究发现,谷胱甘肽的最佳提取条件为:微波处理20.96 s、提取时间为13.25 min,加水量与干细胞的比为22.20 mL/g,谷胱甘肽的提取率为13.06 mg/g,比单因素试验最高的提取率高8.3%,且与预期值相符。