新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究

从构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中筛选到了鲍防御素基因EST.通过序列分析发现该基因的全长cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成.该前体的成熟肽含42个氨基酸(6个Cys),推测分子量为4323Da,等电点为8.02.氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性较高,最高可达70%.因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,将其命名为鲍防御素hd-def.采用基因组步移法获得了全长4032bp的基因组序列.分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497bp、2357bp和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中.用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达.实验检测了5种组织,发现hd-def基因仅在肝胰腺中表达,具有明显的组织表达特异性;其表达属于诱导型表达,提示该基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染.     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法设计简并引物从牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝脏中克隆了牙鲆hepcidin抗菌肽基因.牙鲆抗菌肽hepcidin基因组DNA全长821bp,序列分析表明该基因具有3个外显子和2个内含子.cDNA全长588bp,包含一个270bp的开放阅读框,编码一个长89氨基酸的前体肽.RT-PCR分析表明:该抗菌肽基因在正常牙鲆的肝脏、头肾、鳃、脾脏中表达量较高,在心脏、小肠中表达量较低;受到病原鳗弧菌感染的牙鲆各组织该基因表达量明显上升.牙鲆抗菌肽基因的克隆为水产养殖等领域的抗耐病品种的选育提供了基因源,为开发新的生物工程药物提供了基础理论和实验数据.     

大豆NBS类抗病相关基因的克隆与序列分析

根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR方法从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得两个通读的大豆NBS类抗病基因同源片段RNEAU-1和RNEAU-2,长度均为513bp,编码171个氨基酸。以RNEAU-1为靶序列,采用RACE方法获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SR1,该基因包括3411bp的开放读码框,72bp的5′非翻译区(non-translated region,NTR),68bp的3′非翻译区和20bp的多聚腺苷酸尾。编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列,基因编码产物具有TIR、NBS、LRR、HD(conserved domain 1)和conserved domain 2等一系列抗病基因的保守结构域。同源性比较和序列分析显示,该基因为大豆中TIR-NBS-LRR类抗病相关基因。Southern杂交结果表明,SR1基因(或其同源基因)在大豆中具有2～4个拷贝。RT-PCR检测表明,SR1基因在大豆中为低丰度组成型表达,其表达不受病原菌接种和水杨酸的诱导,亦无组织特异性。以绥农10号基因组DNA为模板扩增得到长度为3972bp的SR1基因转录区核苷酸序列,其结构包含5个外显子和4个内含子。SR1基因在GenBank上的登录号为AY193892。     

栉孔扇贝热休克蛋白70基因Cdna的克隆与分析

应用表达序列标签法，获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列，然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp，编码区全长1902bp，可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体，结合Blast分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。     

从鳗弧菌M3 Fosmid文库筛选aroA基因

为克隆鳗弧菌aroA基因 (它在细菌中编码合成芳香族氨基酸的关键酶--5-烯醇氏丙酮酰莽草酸3-磷酸(EPSP)合成酶),在实验室中构建了鳗弧菌M3大分子量基因组Fosmid文库,并通过克隆测序获得了部分序列,以此为基础,通过延伸测序获得了ar oA基因序列全长. 该基因全长1281bp,编码427个氨基酸,包含一个11个氨基酸残基的信号肽;编码区GC平均含量为46.8%,推测分子量为46177 Da.相似性分析表明,鳗弧菌的aroA核苷酸和氨基酸序列与其他弧菌的相似性最高,分别在73%～75%和78%～82%;进化树结果也表明鳗弧菌ar oA与其他弧菌的亲缘关系最近.aroA基因的克隆为构建鳗弧菌弱毒疫苗奠定了基础.     

利用生物信息数据库克隆玉米基因PIS2与MFSP全长

利用玉米表达序列标签数据库(dbEST)电子克隆了玉米基因PIS2的cDNA全长,并采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术得到了包含该基因完整开放阅读框(ORF)的cDNA序列;借助水稻非冗余核酸数据库联合应用电子克隆技术和RT-PCR技术克隆得到玉米主易化子超家族蛋白基因MFSP的cDNA全长,并进一步利用植物基因组数据库(PlantGDB)快速地获得了该基因的基因组全长序列.研究证实,充分利用分子生物信息数据库,可以简便地克隆得到玉米目的基因的cDNA乃至基因组全长序列.     

条斑紫菜cDNA微阵列制备及其在世代差异基因表达检测中的应用

为了高通量研究不同世代条斑紫菜的基因表达情况,选择了467个包含诸多功能基因的条斑紫菜基因克隆,经PCR扩增纯化后,点样于多聚赖氨酸包被的基片上制备了条斑紫菜功能基因cDNA微阵列.采用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP 荧光分别标记条斑紫菜配子体和孢子体cRNA,与阵列进行杂交后,获得了信号清晰、重复性良好的扫描图像.经对标准化处理后的467个基因的数据进行分析发现:在配子体中表达量上调的基因有55个,其中有21个基因与已知功能基因或推测功能基因相匹配;在孢子体中表达量上调的基因有86个,其中与已知功能或假定功能基因相匹配的基因有24个.实验证明,优化的cDNA微阵列制备技术用于条斑紫菜基因表达分析有较高的效率和可靠的实用性能.     

真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的策略,设计了3对引物,首次分离、克隆了2820bp的真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因组序列,该序列在GenBank上注册(注册登录号为AY965686).经过剪接、比较,分析了真鲷MSTN基因的序列和结构特征.真鲷的MSTN基因具有3个外显子、2个内含子,整个开放阅读框编码着384个氨基酸,第1个外显子上有一个连续11个Q氨基酸的残基,C-末端具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点.在第1、第2内含子和3'非翻译区上分别具有一个微卫星重复序列.RT-PCR分析表明,MSTN基因在真鲷不同组织中都有表达,但表达量具有明显的差异;MSTN在肌肉中表达量最高,其次是脑、小肠、头肾、鳃和性腺,心脏、眼睛、肝脏中只有极少量表达,脾脏中没有检测到MSTN的表达.     

中国明对虾凝血栓蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达特征

获得了中国明对虾凝血栓蛋白(TSP)基因全长cDNA,该基因由2868个碱基组成,具有一个2763bp的开放阅读框,编码920个氨基酸,其中包含21个氨基酸组成的信号肽.中国明对虾TSP由四类不同的结构域组成,从N端开始顺序为几丁质结合结构域,EGF-like结构域,Type Ⅲ repeat和TSP carboxyl-terminal domain(TSP-C结构域).结构域分析发现,中国明对虾的N端不具有TSP N-terminal domain(TSPN结构域),但有一个几丁质结合结构域,其C端的Type Ⅲ和TSP-C结构域非常保守.该基因在弧菌感染后的对虾淋巴器官和肝胰脏中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾TSP基因在免疫反应中具有重要作用.     

斑马鱼ILF2基因的电子克隆分析

利用电子克隆方法,成功获得了ILF2基因在斑马鱼中的同源基因,为进一步研究斑马鱼ILF2基因功能奠定了基础.斑马鱼ILF2基因cDNA全长为1560bp,含有一个编码387个氨基酸的完整开放阅读框架.比较斑马鱼ILF2基因和人ILF2基因,显示两者编码氨基酸序列相似性为87%,核苷酸序列有72%相同.     

水稻小GTP蛋白基因Osrab5B基因的克隆和鉴定

用已知遗传图位的BAC克隆片段,对水稻（Oryza sativa)小穗cDNA文库进行筛选,获得一个水稻小GTP结合蛋白（small GTP-binding protein,SGP)的相关序列,序列测定后以该cDNA序列为基础将４个表达序列标记（EST）进行了电子克隆（electronic cloning),根据电子克隆结果设计引物,利用RT－PCR方法获得了一个水稻（Oryza stiva)中尚未鉴定的cDNA克隆Osrab5B,长1016bp。它与龙船海棠属（Mesembryanthemum crystallinum)和百脉根属（Lotus japonicus)命名为rab5B基因（序列登录号分别是AJ006225和Z73939）有着高度同源性（cDNA核苷酸序列ID值分别大于74％和76％）,同属rab家族的一个新的亚族。进而根据Osrab5B的cDNA序列设计引物,扩增得到Osrab5B的基因组克隆,序列分析表明它至少有7个内含子和8个外显子。     

节旋藻硝酸盐转运蛋白基因Amnrt P序列分析

应用生物信息学软件对获得的节旋藻硝酸盐转运蛋白基因(Amnrt P)全长序列进行了结构特征、同源性比较、多序列比对、系统发育学分析等.结果表明:该基因全长为1515 个核苷酸,编码 504 个氨基酸,平均 GC 含量为43.8%,疏水氨基酸的比例为47.6%.该硝酸盐转运蛋白含有 12 个跨膜结构域(Transmembrane domains,Tm),膜拓扑结构与 NRT2 家族的类似,并发现了多个 NRT2 家族的保守序列.同源性搜索显示与属于 NRT2 基因家族的海洋蓝藻的氨基酸序列相似性为75%～89%.采用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建了分子系统树,结果表明 3 种树的拓扑结构基本相似,并且在蓝藻中基于硝酸盐转运蛋白基因的系统发育关系与形态学分类结果相一致.所获 Amnrt P 基因属于 NRT2 基因家族,可成为蓝藻系统进化研究的分子标记,并为了解节旋藻中硝酸盐吸收与转运的基因结构和分子机制奠定了一定的基础.     

茶尺蠖普通气味结合蛋白基因片段cDNA的克隆与序列分析

根据同源性设计简并性引物,采用RT-PCR方法扩增出了茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP1和GOBP2的基因cDNA片段,大小分别为415 bp和352 bp.测序结果在NCBI中经BLAST搜索,结果表明,两者与已报道的鳞翅目昆虫的气味结合蛋白基因片段或全长的同源性分别为79%~83%和78%~90%.根据两个核苷酸片段推导出的氨基酸残基数分别为138个和117个,均具有6个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白的特点.经BLAST搜索,与其他鳞翅目昆虫GOBP1和GOBP2氨基酸序列的同源性分别为62%~82%和76%~88%.     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)一种CXC趋化因子的克隆及其表达特征

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到一种CXC趋化因子。它的全长cDNA含有一个81bp的5’UTR,一个414bp的开放阅读框和一个449bp的3’UTR。开放阅读框编码了137个氨基酸残基。经过PCR扩增发现,该CXC趋化因子基因内含有4个外显子和3个内含子。RT-PCR分析表明,大菱鲆CXC趋化因子在正常脾脏和头肾中表达强烈;在胚胎的不同发育时期,大菱鲆CXC趋化因子从体节期开始才有微弱的表达。大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染后6h也有强烈的表达。这些结果表明该CXC趋化因子在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

外来入侵生物福寿螺β-actin基因片段的克隆及表达分析

采用RT-PCR的方法首次对入侵我国福寿螺的β-actin基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并通过氨基酸序列分析推导与其他相关物种的亲缘关系.结果表明,获得的福寿螺β-actin基因cDNA片段大小为840bp,核酸编码有280个氨基酸序列,与其他物种具有高度的同源性.通过邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,福寿螺首先与软体动物聚为一簇,然后与节肢动物聚为一簇,再与脊椎动物聚为一簇.此外,RT-PCR结果显示,β-actin基因在福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉等4个组织内的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

半滑舌鳎促黄体激素基因克隆和表达分析及其血清浓度测定

利用RACE技术首次克隆了半滑舌鳎脑垂体中促黄体激素(LH)基因cDNA全长序列。该基因全长670 bp,开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸。与其他脊椎动物的LH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明:半滑舌鳎LH与鲽形目和鲈形目同源性高58%～68%。另外,半滑舌鳎LH含有12个保守的半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点(19～21 NQT)。实时荧光定量组织表达分析表明,LH mRNA在脑、垂体、卵巢等组织中表达,垂体中表达量最丰富,其他组织尤以脑、性腺表达量较高,推测半滑舌鳎LH可能具有广泛的垂体外生理功能;实时荧光定量PCR方法对繁殖周期雌性半滑舌鳎LH表达水平进行测定,结果表明,LH mRNA在Ⅱ～Ⅵ各繁殖周期的脑、垂体、卵巢3种组织都有表达,但表达水平有差异,在Ⅳ、V期表达量最丰富,说明LH主要促进卵母细胞最终成熟及排卵。利用125I标记的放射免疫测定(RIA)技术检测繁殖周期半滑舌鳎血清LH浓度,结果表明LH在V期含量最丰富,也说明LH主要促进卵母细胞最终成熟及排卵。