绿色荧光蛋白的原核表达、纯化与荧光分析

将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入到pET30（a）＋构建pET30-GFP表达载体，将重组载体导入大肠杆菌BL-21中，经IPTG诱导产生His—GFP融合蛋白，融合蛋白主要存在于可溶性上清中。用镍柱亲合纯化His—GFP，分子量大约为32．4kD，与预期值相符。荧光分析表明，His—GFP与野生型GFP荧光激发及发射波长基本相同，荧光性质稳定，比常用的荧光素（FITC）具有更强的抗荧光淬灭能力。通过此方法制备的绿色荧光蛋白可用于食用色素的开发等。     

碱性蛋白酶抑制剂lupI-MSSS原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化

低温碱性金属蛋白酶MP是从菌株YS-80-122中提取纯化的,属于沙雷氏蛋白酶家族,与该家族报道的其他酶的结构类似,在MP基因下游有一抑制剂基因lup I,该抑制剂可以完全抑制蛋白酶MP的活性。在野生型抑制剂基因的基础上,通过定点突变将Lup I的N端增加Met-Ser-Ser-Ser,命名为Lup I-MSSS,通过构建p ET28alup I-MSSS原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果表明该蛋白的大小约11 kDa,与预测的蛋白分子量一致。对影响蛋白诱导表达的诱导剂添加时间、诱导温度、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导时间4个因素进行优化,并经初步优化得到了其诱导表达的条件为:接种量2%,诱导剂添加时间3 h,诱导剂IPTG终浓度0.5 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为8 h。表达的蛋白依次通过超滤,Superdex 200凝胶过滤层析,Q-Sepharose离子交换层析进行纯化,结果显示目的蛋白纯化倍数为20,比活力为15 720U/mg,活性回收率达60.7%,纯化后的lup I通过高效液相色谱法进行纯度分析,其纯度可达99%以上。     

麻痹性贝类毒素受体蛋白Saxiphilin的克隆与表达

目的麻痹性贝类毒素受体蛋白Saxiphilin可特异性结合麻痹性贝类毒素,本文采用杆状病毒表达载体系统对Saxiphilin进行体外表达研究。方法从牛蛙肝脏克隆得到ssziphilin基因(N端含有自身分泌信号肽),利用特异引物使其C端带上组氨酸标签。结果使用杆状病毒表达载体系统构建带有目的基因的重组病毒,用病毒感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞Sf9以表达Saxiphilin,通过优化细胞培养基中胎牛血清含量及感染时间,确定使用无血清培养基培养,重组病毒感染Sf9细胞72 h时,培养基中可溶性目的蛋白表达量最大。结论通过镍柱纯化得到Saxiphilin蛋白,以期将此蛋白进一步用于麻痹性贝类毒素的检测。     

鲫鱼MBSP的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的原核表达菌株Rosetta(pET28aMBSP),获得重组MBSP,以制备MBSP多克隆抗体。将鲫鱼MBSP全长基因(MBSP)借助表达载体pET-28a构建重组表达菌株Rosetta(pET28a-MBSP),并进行诱导表达后获得重组MBSP。利用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。以纯化后的重组MBSP作为抗原免疫新西兰兔,获得MBSP多克隆抗体。分别采用ELISA和Western blot技术测定其效价和特异性。诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析、Western blot检测及质谱鉴定,结果表明该蛋白质为重组MBSP,其相对分子质量约为28×10~3,与天然MBSP大小一致,主要以包涵体形式存在。将其免疫兔子后,从血清中获得了与MBSP发生特异性反应的高效价多克隆抗体。本研究中成功表达和纯化了重组MBSP蛋白,制备了高效价的特异性MBSP多克隆抗体,为MBSP的相关研究奠定基础。     

莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定

BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2 基因5''端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌 BL21（DE3）细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明：分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting 分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展 BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。     

单核细胞增生李斯特菌ladR基因在两种原核表达载体中的克隆表达及纯化分析

利用特异性引物扩增ladR基因序列,分别构建单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ladR基因的两种原核表达载体,即含有6个His标签的pET-28a-ladR表达载体和含有GST标签的pGEX-4T-ladR表达载体。通过诱导时间、温度和浓度优化两种表达载体的蛋白表达条件,比较分析两种表达载体的LadR蛋白可溶性表达水平,利用Western-Blot进行LadR蛋白表达验证。本研究成功构建了pET-28a-ladR和pGEX-4T-ladR表达载体,在大肠杆菌BL21中分别表达出His-LadR和GST-LadR融合蛋白。通过凝血酶切除GST标签,纯化后得到LadR蛋白。在最佳表达条件IPTG为0.5 mmol/L,22 ℃诱导过夜下,pGEX-4T-ladR表达载体中LadR的表达量比pET-28a-ladR（IPTG为1.0 mmol/L,22 ℃诱导过夜）中His-LadR蛋白的表达量高4.48倍。本研究结果表明,GST标签有利于ladR基因的可溶性表达,为后续的LadR蛋白的功能分析和转录调控机理研究奠定了良好基础。     

凋亡蛋白质的原核表达与纯化

目的构建来自鸡贫血病毒（CAV,chicken anaemia virus）VP3基因编码的凋亡蛋白质表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并研究凋亡蛋白质的纯化和稳定性。方法PCR（polymerase chain reaction）获得正确编码VP3基因片断,构建表达质粒pET-28a-VP3在E．coli BL21（DE3）中表达。用Ni—NTA柱纯化可溶性目标蛋白质,并研究不同条件下凋亡蛋白质的稳定性。结果目标蛋白质在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白质纯度高于90％,卡拉胶可明显提高重组蛋白质可溶状态下的稳定性。结论成功获得高纯度VP3可溶性蛋白质,增加了目标产物的稳定性,为进一步研究该蛋白质的临床应用奠定基础。     

几丁质结合蛋白基因克隆、表达与纯化

该研究通过聚合酶链反应（PCR）方法从假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.）DL-6菌株中成功克隆了几丁质结合蛋白基因。PCR测序结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,其理论分子质量为58.517 ku,等电点（pI）4.35,命名为CBP58（GenBank登录号KF234016）。结构域分析结果表明,该蛋白包括1个33家族碳水化合物结合模块（CBM）,2个类型3几丁质结合域（ChtBDs）;用Insight II 2005软件以同源建模的方法构建CBP58蛋白CBM33结构域的三维结构模型,Ramachandram图谱检测和三维结构评估显示模型结构合理,整体相容性较为可信;将CBP58基因构建到pET23b载体,并转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达;利用镍柱亲和层析纯化获得重组蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示目的蛋白可溶表达,为后期几丁质结合蛋白（CBP）的生化性质表征奠定理论基础。     

猪β_2肾上腺素受体的表达、纯化及鉴定

研究了β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor,β2AR)基因重组表达质粒在人胚肾细胞293(Human embryonic kidney cells293,HEK293)中的瞬时转染及表达产物的纯化和鉴定。将已构建的重组表达质粒瞬时转染HEK293细胞,表达产物制备粗膜蛋白后,采用镍离子亲和层析法纯化得到受体蛋白并进行鉴定。结果表明:重组表达质粒p Tri Ex-1.1 Hygro-β2AR1-418转染HEK293细胞后表达量和蛋白活性较优,最佳表达时间为转染后72 h。SDS-PAGE和Western blot结果显示,在47 ku左右出现了特异性条带,咪唑的最佳洗脱浓度为250 mmol/L,受体蛋白纯度大于80%。活性鉴定表明:受体蛋白与HRP酶标记的3种β激动剂均能特异性结合,检测HRP-克伦特罗、HRP-莱克多巴胺和HRP-沙丁胺醇的OD值分别为0.97、0.91和0.94。通过纯化得到的受体蛋白,约占粗膜蛋白的4.4%。本试验成功获得一定数量纯度和活性较好的β2AR受体蛋白,为受体技术在β激动剂多残留检测中的研发和应用奠定了基础。     

莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT25是维持纤毛运动和感知所必须元件纤毛内运输蛋白IFT复合物B中的重要组分之一,探索IFT25尤其在模式生物莱茵衣藻中的作用机制具有重要作用。作者采用经济和简单的方法,制备莱茵衣藻IFT25的兔源多克隆抗体。将ift25分别连接到pMAL-c2X-和pET-28a(+)-载体上,转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导大量表达,并经亲和纯化后蛋白质纯度超过90%。通过颈背部皮下多次免疫8周龄大的新西兰大白兔,制备多克隆抗体,取第五次免疫后血清用ELISA测定效价超过128 000。抗血清依次经过Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blotting检测抗体特异性,结果表明制备的抗体可以特异性识别莱茵衣藻中的IFT25,为IFT25作用机制的阐明和纤毛相关疾病的诊断提供了重要理论和方法支持。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

洋葱伯克霍尔德氏菌L68邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、表达和纯化

采用自行设计的引物,从洋葱伯克霍尔德氏菌L68中PCR扩增得到phnE（邻苯二酚2,3-双加氧酶）基因,亚克隆到高表达载体pET 32a上,转入表达菌株中.经双向测序,证实构建过程中未出现突变.重组子经IPTG诱导后,可以表达有活性的重组双加氧酶.选择26 ℃进行重组蛋白诱导.薄层扫描显示,表达重组蛋白总量最高可占总蛋白的64.92%.利用金属螯合层析对重组蛋白进行了一步纯化,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白纯度达到95%.     

单核细胞增多性李斯特菌iap 基因的克隆、表达与p60 蛋白的纯化

以单增李斯特菌基因组DNA 为模板,利用自行设计的引物,通过PCR 法扩增出单增李斯特菌的iap 基因。在iap 基因的5 ＇端和3 ＇端分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ 2 个酶切位点将其克隆到pMD-18T 载体上,构建克隆载体pMD-18T-iap。经测序正确后,将iap 基因克隆至表达载体pET-28a 上构建表达质粒pET-28a-iap。在IPTG 诱导下,携带pET-28a-iap 的E.coli BL21(DE3)高效表达分子质量约为60kD 的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白含量的76.3% 左右。诱导表达的可溶性蛋白通过Ni2+ 亲和层析柱纯化得到纯度在95.6% 以上的重组p60 蛋白,其提取率为68.3% 左右。     

人源磷脂酶PLA2异源可溶表达纯化及酶学分析

为实现人源磷脂酶A₂的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA₂（PLA2G10）,并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白（MBP）为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA₂,转化E.coli BL21（DE3）后,经PTG低温诱导表达,SDS-PAGE鉴定后,确认其在上清中大量表达。根据蛋白的性质建立了一整套蛋白纯化工艺,包括Q柱洗脱,硫酸铵盐析,Phenyl柱纯化,Amylose柱纯化,分离纯化获得重组酶,SDS-PAGE测定该酶纯度大于90%。以卵磷脂为底物,酸碱滴定法测定其比活为127.04 U/mg,纯化得率48.8%,纯化倍数为10.3倍。酶学性质研究表明,该酶的分子量为56.5 kDa,最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,是钙离子依赖酶,对PC亲和能力最强,K_m值为12.2 mmol/L,V_max为0.19 mmol/L/min。本试验建立的磷脂酶A₂的异源表达、纯化体系,为其进一步的理论和工业研究奠定了基础。     

芹菜过敏原蛋白Api g1.02的克隆、表达及单抗制备

提取芹菜总RNA,反转录PCR(RT-PCR)扩增出过敏原蛋白Apig1.02基因,经PCR、酶切和序列测定后,得到重组质粒pET-32a-Apig1.02。将重组质粒转化到BL21(DE3)pLys感受态细胞中,用1mmol/L异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)对转化菌进行诱导表达及SDS-PAGE分析后,将表达蛋白提取纯化,制备单克隆抗体并进行Western blot分析。结果表明芹菜过敏原蛋白Apig1.02在体外获得了高效表达,表达融合蛋白分子质量约35ku,诱导6h后表达量最高,占菌体总蛋白的40%左右;制备的单克隆抗体能与表达蛋白发生免疫印迹反应,说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。该研究结果为建立芹菜过敏原蛋白的免疫学检测方法奠定了基础。     

精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

通过PCR扩增得到菌株编码ADI的arcA基因,并构建表达载体pET24a-ADI。将该载体导入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达ADI基因的重组菌。对ADI诱导表达条件进行优化,结果发现宿主菌在A600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在30℃诱导4 h酶活最高,为2.04 U/mL发酵液。经超声波破碎、HiPrep DEAE FF阴离子交换层析、SuperdexTM200凝胶过滤层析,可获得SDS-PAGE电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)。rADI相对分子质量大小为92 600,由两个相同亚基组成,纯化后的rADI比酶活达20.9 U/mg。     

植物乳杆菌DMDL 9010中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

研究了植物乳杆菌DMDL 9010亚硝酸盐还原酶基因克隆、表达及表达产物的纯化。首先以植物乳杆菌DMDL 9010的DNA为模板,利用PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,扩增后nir编码序列大小为1638 bp,再将其编码序列克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化到感受态细胞DH5α,成功构建重组质粒p ET-32a(+)-nir。将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21中,在IPTG浓度为1 mmol/L和诱导温度为25℃的条件下诱导4 h后诱导表达NIR蛋白,经诱导后的工程菌能将50μg/m L的亚硝酸盐降解90%以上,利用亲和层析柱Ni sepharose 6 Fast flow进行纯化得到重组蛋白,该重组蛋白经SDS-PAGE电泳后的分子量约为60 KDa。总之,经由植物乳杆菌DMDL 9010克隆出亚硝酸还原酶基因,并成功构建了重组质粒p ET-32a(+)-nir,利用基因工程方法得到的工程菌能有效降解亚硝酸盐,并能利用亲和层析得到高纯度的NIR。     

金黄色葡萄球菌肠毒素SEK的纯化及DAS-ELISA检测方法的建立与应用

本研究目的为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK的双抗夹心酶联免疫吸附方法。将构建的原核表达载体pET-28a(+)-ΔNspSEK转化入BL 21(DE3)pLysS细胞中诱导表达,经Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化获得重组SEK蛋白作为抗原。利用双抗夹心酶联免疫方法检测程序,确定抗SEK单克隆抗体及抗SEK多克隆血清的最佳稀释度,并使用该方法应用于检测SEK人工污染样品的加标回收率和茶多酚及乳酸链球菌素(Nisin)对7株sek阳性菌株的SEK蛋白分泌影响。结果表明,原核表达载体得到可溶性表达,重组SEK蛋白分子量约为27.7ku;建立的双抗夹心酶联免疫检测方法中,单克隆抗体最佳包被浓度为2.89μg/mL、抗血清的最佳稀释度为1:500,回归方程为y=0.2165x+0.1627,相关系数R~2=0.9993,最低检测限为0.1μg/mL;检测SEK人工污染脱脂奶、LB肉汤和牛肉糜中的加标回收率高达97%以上;并且,采用建立的方法测得茶多酚和Nisin的添加浓度在其MIC及以下浓度时,茶多酚对7株sek阳性菌株蛋白分泌抑制效果更明显。