蛹虫草Cordyceps militaris JN168菌株的诱变育种及液态发酵产虫草素

利用离子束、亚硝基胍及离子束-亚硝基胍诱变法处理蛹虫草Cordyceps militaris JN168,初步获得了几株较高产虫草素的菌株。通过进一步筛选得到复合诱变菌2,并对该菌的液态发酵培养基组分进行了优化。实验结果表明:蛹虫草液态发酵产虫草素的最佳培养基组分为(g/L),葡萄糖40,酵母浸粉25,Mg SO4·7H2O 0.6,K2HPO4·3H2O 0.6,KH2PO40.6。优化后虫草素产量提高了5倍,最高达1 045.65 mg/L。     

虫草头孢菌粉抗心律失常活性成分的分离纯化及结构鉴定

目的：研究虫草头孢(Cephalosporium sinensis)菌粉的抗心律失常活性成分。方法：在活性检测结果的指导下,采用硅胶柱色谱法、ODS RP C18高效液相色谱法分离纯化虫草头孢菌粉中的抗心律失常活性化学成分,根据化合物的理化性质和波谱数据鉴定其化学结构。结果：从虫草头孢菌粉乙醇提取物的水饱和正丁醇萃取部位中分离得到5个化合物,分别是尿苷(化合物1)、胸苷(化合物2)、腺苷(化合物3)、2’-脱氧尿苷(化合物4)、尿嘧啶(化合物5)。结论：核苷类化合物为虫草头孢菌粉中的主要的抗心律失常成分。     

鱼源藤黄微球菌三重PCR检测法的建立及耐药性分析

为鉴定感染黄颡鱼菌株fsznc-CL、建立一种快速检测的方法和探讨其耐药特性。采用形态学、理化特性及16S rDNA序列分析方法进行菌株鉴定,人工回归感染研究其致病性。通过对三对特异性引物的反应体系和条件进行优化,建立一种三重PCR检测法并应用到人工感染黄颡鱼的检测中。运用PCR方法扩增耐药基因,用琼脂纸片扩散法检测该菌的药敏特性。结果表明,分离菌株fsznc-CL为藤黄微球菌(Micrococcus luteus),该菌对黄颡鱼具有一定的致病性。三重PCR检测法可准确扩增出藤黄微球菌CBS、Sig和Pol三对目的基因,而其他菌株未扩增出,检测该菌的最低模板浓度为5.822×10-3 ng/μL,该方法检测带菌样品的阳性率约为83.33%。该菌携带了TEM、aph(3')-Ⅱa、aac(6')-Ⅰ、Sul1和Sul2耐药基因。菌株fsznc-CL对诺氟沙星、苯唑西林、红霉素和呋喃唑酮耐药。本试验建立的三重PCR检测法具有较高的特异性和灵敏度,目前藤黄微球菌对少部分抗生素耐药。     

复合北虫草乳酸菌制剂制备技术研究初探

探索了利用北虫草提取物培养乳酸菌,以期提高发酵液活菌数,进行了单菌种和双菌种混合发酵研究,并试制了具有北虫草和乳酸菌双重功能的复合北虫草活性乳酸菌制剂样品。研究结果表明,北虫草提取物对试验菌株生长具有促进作用,提高发酵液活菌数约10倍,实验室条件下单菌种和多菌种混合发酵液活菌数可达到109cfu/mL以上;制备的北虫草活性菌原粉活菌数最高达1011cfu/g、活性乳酸菌片和活性乳酸菌粉产品活菌数达107～109cfu/g。该产品将具有良好保健功能的北虫草和乳酸菌等益生菌相结合,为进一步研究开发复合型保健食品提供依据和思路。     

野生虫草无性型分离株分子鉴定及遗传多样性的研究

虫草具有较高的食用与药用价值,本文以19株野生虫草分离株为研究材料,利用ITS引物进行PCR扩增、测序,并从Genbank上下载虫草属相关序列,构建系统发育树,并对19株虫草无性型分离物进行ERIC-PCR扩增,同时还检测了上述无性分离物发酵液中虫草素的含量。系统发育分析表明在分子水平上19株虫草的无性型分离菌株,都为蛹虫草(Cordyceps militaris)。与高雄山虫草(C.takaomontana)、蝉花(C.cicadae)、古尼虫草(C.gunnii)以及冬虫夏草(C.sinensis)平均遗传距离分别为0.1269、0.1228、0.2251和0.2354,在遗传距离上,与高雄山虫草和蝉花较近,与冬虫夏草较远。ERIC-PCR相似系数在0.8水平上,可以将19个蛹虫草菌株分为3组,相似系数在0.9水平上19株蛹虫草菌种可以分为8组。对蛹虫草发酵液中虫草素含量检测发现,所有蛹虫草无性型分离物发酵液都含有虫草素,最高的可达到126.33 mg/L,为现有的蛹虫草生产菌株JD的119倍。     

食品中荧光假单胞菌双重PCR法检测体系的建立和评价

根据荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)促旋酶(gyrase)的B亚单位基因以及金属蛋白酶(apr)基因设计出两对引物,经过反应条件的优化,建立了用于荧光假单胞菌快速检测的双重聚合酶链式反应(PCR)方法,并对该体系进行评价。结果显示,Pseudomonas fluorescens菌株经普通PCR扩增均可见2条特异性条带(384 bp和194 bp),而其它阴性对照菌株PCR扩增均为阴性。基于基因组DNA的双重PCR检测灵敏度为16.9 fg/μL(3~4拷贝/μL),1.8CFU/m L的UHT牛奶样品(250 m L)经增菌24 h后用该双重PCR方法均可检出。本研究建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏度,能克服乳制品样品基质的干扰,可应用于乳制品中荧光假单胞菌的快速检测。     

2种检测变形杆菌PCR方法的比较研究

选取atpD基因作为靶序列设计了2对引物,分别采用不同的PCR扩增条件,对3株变形杆菌属标准菌株,67株样品分离株及13株非变形杆菌属菌株进行扩增实验,结果2种PCR方法对3株标准菌株和66株样品分离株分别扩增出348 bp和596 bp的特异性片断,实验结果呈阴性的1株分离株经全自动微生物鉴定仪鉴定为阴沟肠杆菌。13株非变形杆菌属菌株均未有特异性条带产生。2种PCR方法检测变形杆菌,均具有快速、准确、灵敏、特异的优点。建立的引物2的PCR方法在检测时间、特异性、灵敏度方面比引物1的PCR方法更具优势。     

食品中大肠杆菌O157∶H7疑似菌株的分离和鉴定研究

采集117份食品样品,经过PCR扩增毒力基因stx1、stx2和O157特征基因rfbO157初筛。将部分PCR阳性的食品样品,经过新生霉素EC增菌液增菌、免疫磁珠富集、血清学鉴定、菌落PCR复筛,分离出5株O157:H7疑似菌株。其中1株O157∶H7疑似菌株EC5.11不能与O157诊断血清产生良好凝集反应,采用血清学方法该菌容易漏筛。采用PCR扩增rfbO157基因和H7鞭毛抗原编码基因fliCH7,EC5.11均呈阳性反应。最终包括EC5.11在内的4株疑似菌株被证实为O157∶H7血清型。本研究提出了一种改良方法筛选、鉴定食品中O157∶H7疑似菌株,比起传统方法,减少工作量的同时提高了筛选的特异性。     

食品中弓形菌16S rRNA特异性扩增检测方法的建立

针对弓形菌16SrRNA基因合成1对引物,通过对聚合酶链式反应(PCR)扩增条件的优化,建立了检测弓形菌的PCR方法。3株弓形菌标准菌株PCR产物测序结果与NCBI上公布的弓形菌16S rRNA基因序列进行比对,比对结果表明3株弓形菌测序结果与NCBI上公布的弓形菌16S rRNA基因序列同源性均在99%以上。3株弓形菌标准菌株均特异性地扩增出了长度为1202bp的片段,其他19株不同种类的菌株均无扩增产物出现。55份食品样品用Johnson-Murano肉汤增菌后用此法进行检测,其中6份样品为弓形菌阳性,阳性率为10.9%。上述实验结果表明,方法特异性强、操作简便,节省了检测时间,可用于食品中弓形菌的快速检测。     

冬虫夏草及其产物免疫调节作用研究进展

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合物,具有重要的药理作用。对虫草多糖、虫草菌丝体/子实体,以及虫草提取物和发酵产物在免疫调节方面的最新研究进展进行了综述。     

55株芽孢杆菌16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析

采用16S rRNA基因序列分析法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CCIC)保藏的55株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行复核鉴定。菌株经纯化培养,以改良CTAB法提取总DNA,采用细菌16S rRNA通用引物、TD-PCR方法(touchdown-PCR)进行16S rRNA基因序列扩增,PCR产物纯化后直接进行序列测定,序列经人工校对后用Clustal X进行比对分析,最后用MEGA3.1软件构建系统发育树。系统发育分析结果表明:55株枯草芽孢杆菌中有52株菌种与原鉴定结果一致,有3株菌种与原鉴定结果存在差异,其中2株鉴定结果为巨大芽孢杆菌(B.megaterium),另1株鉴定结果为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。     

Quality control method of sterols in fermented Cordyceps sinensis based on combined fingerprint and quantitative analysis of multicomponents by single marker

In this study, we established a new pattern for differentiating and comprehensively evaluating the quality of fermented Cordyceps sinensis based on high-performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint analysis combined with similar analysis (SA), principal component analysis (PCA), hierarchical cluster analysis (HCA), and the quantitative analysis of multicomponents by single marker (QAMS). These methods indicated that fermented Cordyceps sinensis samples could be categorized into one class by PCA and HCA. The fingerprints of fermented Cordyceps sinensis were established, and four HPLC peaks were identified as ergosterol, daucosterol, stigmasterol, and β-sitosterol in Jinshuibao capsules and tablets (two products of fermented Cordyceps sinensis). Ergosterol was chosen as the internal reference substance, and the relative correction factors (RCFs) between ergosterol and the other three sterols were calculated using the QAMS method. Moreover, the accuracy of the QAMS method was confirmed by comparing the relative error between the results of the method used with those of an external standard method (ESM). No significant difference between the two methods was observed. The total sterols content in Jinshuibao products were calculated by the QAMS method, and the total sterols content of the two products were similar. This study showed that the method established herein was efficient and successful in the identification fermented Cordyceps sinensis and may further act to facilitate systematic quality control of fermented Cordyceps sinensis products.     

四川泡菜盐卤中微生物总基因组DNA提取方法的比较

了得到较高质量的基因组脱氧核糖核酸（DNA）,本实验采取了5种方法对四川泡菜盐卤总基因组进行提取,对其提取的浓度、纯度进行分析比较,并以此为模版进行聚合酶链反应（PCR）体外扩增。结果表明,F1所得的基因组DNA纯度及浓度最高,F4方法提取的基因组DNA浓度较高,但受到蛋白或酚类物质的污染,F2以及F5两种方法得到的基因组DNA浓度较低,F3所得的基因组DNA浓度低并且含有较多RNA杂质。因此,本研究采用的5种对四川泡菜盐卤进行总基因组提取方法中,方法F1最合理、高效。:     

冬虫夏草与蛹虫草融合株的原生质体诱变育种

以冬虫夏草与蛹虫草融合株为研究材料,对其原生质体进行紫外诱变,筛选优质高产的新型菌株。得到了高产菌株Y-90,虫草酸产量是出发菌株的1.80 倍,高产菌株YP-42,虫草素产量是出发菌株的1.33 倍。采用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）分子标记技术和核糖体rDNA内部转录间隔区（internaltranscribed spacer,ITS）序列分析技术对突变株的遗传变异情况进行分析。结果表明突变株的ITS序列并没有发生变化。RAPD结果显示突变株的扩增片段与亲本菌株不同,说明发生了基因突变,其高产性状是可遗传的性状,可以将其用于进一步的育种研究。     

虫草及其制品中D-甘露醇检测技术研究进展

D-甘露醇是虫草及其制品中主要的生物活性成分,是评价虫草及其制品品质或进行质控的重要指标,虫草及其制品又被广泛用于保健食品、功能食品、医药等的制作。实现对D-甘露醇的有效检测,是虫草的科学培育,虫草及虫草制品的研究、加工与质量控制等的重要前提。目前对天然或人工培养虫草与虫草相关制品中D-甘露醇的检测已有大量研究,但缺乏系统的评述。本文综述了现有虫草及其制品中D-甘露醇检测技术的研究进展,比较分析了不同检测方法的优势与不足,对领域现有问题进行分析并对后续研究进行展望,以期对现有D-甘露醇检测技术的完善或开发新型检测方法提供指导,同时,为虫草及其制品的进一步开发研究、质量监控及相关细分检测标准的制定提供参考。     

A short‐cut DNA extraction from cod caviar

Caviars represent the most consumed form of fish roe products. Due to high demand, ingredient roes of fish are often susceptible to illegal substitution with those of related fish. This study developed a simple and inexpensive protocol enabling the rapid extraction of DNA of acceptable quality and amount to PCR amplification from both cod caviars and their ingredient pollack roes. The protocol was based on extracting total genomic DNA from eggs using urea and a Chelex 100 chelating resin, and could be completed in less than 15 min. Approximately 8 µg of DNA were reproducibly obtained from single eggs of cod caviars and pollack roes in eight individual experiments, and the quality and amount of DNA were sufficient to serve as template for hundreds of PCR reactions of polymorphic DNA markers for phylogenetic analysis. Being applicable to various caviars, this protocol can be useful to detect illegal substitution among ingredient roes of related fishes in PCR‐based food inspection. Copyright © 2005 Society of Chemical Industry     

Real-time polymerase chain reaction detection of bovine DNA in meat and bone meal samples

We describe a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay for the detection of bovine DNA extracted from meat and bone meal (MBM) samples. PCR primers were used to amplify a 271-bp region of the mitochondrial ATPase 8-ATPase 6 gene, and a fluorogenic probe (BOV1) labeled with a 5' FAM reporter and a 3' TAMRA quencher was designed to specifically detect bovine PCR product. The specificity of the BOV1 probe for the detection of the bovine PCR product was confirmed by Southern blot hybridization analysis of the probe with PCR products generated from ovine, porcine, and bovine genomic DNA extracted from blood and with PCR products generated from genomic DNA extracted from single-species laboratory scale rendered MBM samples. The specificity of the BOV1 probe was also evaluated in real-time PCR reactions including these genomic targets. Both methods demonstrated that the BOV1 probe was specific for the detection of bovine PCR product. The BOV1 probe had a detection limit of 0.0001% bovine material by Southern blot DNA probe hybridization analysis and a detection limit of 0.001% bovine material in the real-time PCR assay. Application of the real-time PCR assay to six industrial samples that had previously tested positive for the presence of bovine material with a conventional PCR assay yielded positive results with the real-time PCR assay for four samples.     

16SrRNA序列分析在沙门氏菌鉴定分型中的应用

目的建立103株28种血清型沙门氏菌16SrRNA的进化树,了解沙门氏菌进化关系,为基于16SrRNA序列分析对沙门氏菌鉴定分型提供理论基础。方法使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增16SrRNA基因片段后进行测序,将序列提交到Genebank和RDP核糖体数据库进行比对,下载相关参考序列,使用MegAlign软件Clustal-V法构建进化树。结果根据16SrRNA同源性能够把103株沙门氏菌聚类成不同群,部分菌株可以鉴定到血清型,部分菌株可以在血清型内进一步区分,虽然与传统血清学分型不能一一对应,但是能形成独立的分型系统。结论 16SrRNA基因序列分析是对沙门氏菌进行鉴定分型及溯源分析的有效方法。     

两株土壤放线菌ZSM-1和ZSM-2的分离与鉴定

对分离自土壤的2 株编号为ZSM-1和ZSM-2的放线菌进行分类鉴定,提取基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）后经聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增菌株16S rDNA,基因测序并进行同源性分析,构建进化树并进行系统发育分析,结合培养特征、生理生化特征,将该2 株菌分别鉴定为纳士维尔链霉菌（Streptomyces nashvillensis）与土地戈登氏菌（Gordonia terrae）。