婴儿粪便长双歧杆菌的分离与多样性分析

本研究旨在分析婴儿粪便长双歧杆菌的多样性,采用改良MRS培养基从哈尔滨地区健康婴儿粪便中分离双歧杆菌,采用生理生化实验结合16S rDNA和热应激蛋白60基因(heat-shock protein 60,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌多态性。实验从11个婴儿体内分离得到18株厌氧的细菌菌株,经形态学分析、生理生化实验、16S rDNA测序及hsp60测序实验发现,其中7株为长双歧杆菌长亚种,3株为长双歧杆菌婴儿亚种。RAPD和MLST结果表明:7株长双歧杆菌长亚种为6个基因型,3株长双歧杆菌婴儿亚种为2个基因型,上述结果说明不同人源婴儿粪便长双歧杆菌基因型差异较大。     

动物双歧杆菌乳亚种V9连续传代过程中遗传稳定性评价

目的:以具有优良益生特性的动物双歧杆菌乳亚种V9为研究对象,对其连续传代过程中的遗传稳定性进行研究。方法:动物双歧杆菌乳亚种V9在TPY培养基中连续培养100代,对其0,25,50,75,100代的菌体形态、碳水化合物利用情况以及结合比较基因组学进行综合分析。结果:动物双歧杆菌乳亚种V9在连续传代过程中不同代时的菌体形态、碳水化合物利用情况均无显著差异(P＞0.05),并以动物双歧杆菌乳亚种V9原始基因组作为参考序列,研究发现不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9的基因组大小和GC含量与原始基因组均无显著差异(P＞0.05),系统发育树结果表明不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9与原始基因组亲缘关系较近,通过识别SNP突变位点发现不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9基因组保守,均未发现稳定遗传的突变位点,进一步进行碳水化合物代谢活性酶注释,结果发现不同代时菌株具有相似的碳水化合物代谢相关基因,遗传特征高度相似。结论:本研究从表型特性和基因组层面综合评估了动物双歧杆菌乳亚种V9的遗传稳定性,可为其进一步开发研究及产业化提供保障。     

长双歧杆菌W13 的全基因组序列分析

长双歧杆菌由于其具有的益生功能而备受关注,该文旨在基于全基因组分析,揭示长双歧杆菌W13（Bifidobacterium longum W13）的基因特性,分析其功能基因和代谢通路。结果表明,长双歧杆菌W13 隶属于长亚种,通过直系同源蛋白分组比对（evolutionary genealogy of genes：non-supervised orthologous groups,eggNOG）数据库注释,发现氨基酸代谢、碳水化合物代谢是该菌株的主要代谢功能;通过京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库注释,发现菌株中含有较多的群体感应相关基因,表明该菌株可促进肠道稳态。通过碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes,CAZy）数据库注释,发现该菌株具有较高的糖合成能力。最后,通过比较基因组分析,发现长双歧杆菌长亚种的遗传多样性和稳定性较高,相较于其他长双歧杆菌长亚种,菌株W13 含有其特定的功能基因。综上表明菌株W13 具有一定的益生功能,有开发为益生菌的潜力。     

双歧杆菌生物膜成膜规律及特性研究

为研究双歧杆菌生物膜的成膜规律及其特性,利用微孔板成膜法对长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、短双歧杆菌等7个种49株双歧杆菌的生物膜成膜能力进行分析。结果显示,双歧杆菌的成膜能力为菌株特异性,不存在菌种特异性;激光共聚焦显微镜观察发现,双歧杆菌生物膜具有一定的组织结构。培养条件显著影响双歧杆菌的成膜能力,葡萄糖、氯化钠和硫酸镁对双歧杆菌的成膜能力均有一个最适浓度,该最适浓度具有显著的株间特异性。进一步研究发现,生物膜状态的双岐杆菌较浮游状态耐热、耐氧能力大幅度提升,最高可达21倍以上,且不同菌株间的胁迫耐受性存在显著差异。     

成人粪便中长双歧杆菌长亚种的分离鉴定及多位点序列分型分析

为了对成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种进行多位点序列分型分析,采用改良MRS培养基从健康成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种,通过生理生化试验结合16S rDNA和热应激蛋白60(heat-shock protein,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌长亚种的基因多态性。从12个健康成人体内分离得到24株厌氧的细菌菌株,经形态学观察、生理生化试验、16S rDNA及hsp60同源性分析发现,其中14株分离株为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp. longum)。MLST结果表明:14株长双歧杆菌长亚种可分为10种基因型,且均与Bifidobacterium longum subsp. longum ATCC 15707为不同基因型。健康成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种具有较大的基因多态性。     

利用低聚半乳糖双歧杆菌的筛选及益生特性研究

短链低聚半乳糖(SC-GOS)是双歧杆菌的有效增殖因子。本试验从婴儿粪便样品中筛选得到7株高效利用SC-GOS的双歧杆菌，经16S rDNA鉴定，它们为1株为长双歧杆菌婴儿亚种BI_Y46，2株为两歧双歧杆菌(BB_Y22、BB_S7)，2株假小链双歧杆菌(BP_Y43、BP_YA)以及2株长双歧杆菌(BL_S34、BL_H26)。以婴儿双歧杆菌M63和婴儿双歧杆菌ATCC 15697为对照，观察菌株形态并分析益生特性，初步筛选出具有应用潜力的益生菌株。结果表明，BI_Y46形态特殊，分叉状有菌毛；BB_Y22、BP_Y43的胞外多糖产量超过0.45 mg/mL；BL_H26菌体表面蛋白含量较高，为0.74 mg/mL，BB_Y22、BB_S7含量在0.35~0.45 mg/mL范围；同时BP_Y43、BB_Y22具有较强的表面疏水性和自聚集能力；在模拟胃液中及胆盐存在下，BB_Y22、BI_Y46对胆盐和胃液的刺激显示出较强的耐受性。抑菌试验显示BI_Y46、BB_S7上清液对大肠杆菌ATCC 25922的抑菌效果较强。结论:长双歧杆菌婴儿亚种BI_Y46、两歧双歧杆菌BB_Y22以及假小链双歧杆菌BP_Y43具有较好的益生潜力，为开发含有低聚半乳糖和双歧杆菌的产品提供一定参考。     

新疆维吾尔族肠道中高产胞外多糖双歧杆菌的筛选及其抗氧化活性

使用Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂和BSM培养基作为筛选平板,结合重复基因外回文序列-聚合酶链式反应和16S rRNA序列分析,对新疆维吾尔族婴儿及其母亲粪便中的双歧杆菌(Bifidobacterium)进行分离鉴定,并筛选出高产胞外多糖的双歧杆菌,测定其多糖的抗氧化活性以及菌株的耐受性和黏附性。结果显示,20份粪便样品中共分离出52株双歧杆菌,其中假小链双歧杆菌(B. pseudocatenulatum)14株,假长双歧杆菌(B. pseudolongum)8株,两歧双歧杆菌(B.bifidum)9株,短双歧杆菌(B.breve)7株,长双歧杆菌婴儿亚种(B.longumsubsp.infantis)5株,动物双歧杆菌乳亚种(B. animal subsp. lactis)6株以及长双歧杆菌(B. longum)3株。经过表型初筛和苯酚-硫酸法复筛,共筛选出7株高产胞外多糖的双歧杆菌,37℃发酵36 h后胞外多糖产量均可达400 mg/L以上。抗氧化活性实验结果表明7株双歧杆菌所产的胞外多糖对过氧化氢自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基均有一定的清除能力。此外,菌株BF66-16相较于其他几株双歧杆菌具有较强的胃肠液耐受性以及黏附性,因此来源于婴儿粪便的BF66-16可以作为潜在的抗氧化菌株应用于制药和食品工业中。     

实时荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,并设计引物和探针,建立一种婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）的实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-fqPCR）鉴定方法。通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对该方法进行验证,并对市售的64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的婴幼儿配方乳粉样品进行检测。结果表明,atpD基因在动物双歧杆菌乳亚种间具有较高的种间特异性,种间差异率＞10%,确定其为目标基因。基于该基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测动物双歧杆菌乳亚种,检测绝对灵敏度可以达到1 pg/μL,相对灵敏度可以达到103 CFU/mL;基因水平和培养物水平抗干扰能力良好。采用该方法从64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的乳粉样品中均能检测出动物双歧杆菌乳亚种,表明基于atpD基因建立的RT-fqPCR方法能够快速准确的对动物双歧杆菌乳亚种进行检测。     

利用种特异性寡核苷酸探针鉴定5种人源双歧杆菌的初步研究

为了对5种常见于保健食品的双歧杆菌（长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌）进行快速鉴定,在16srRNA基因同源性分析的基础上,设计了5个种特异性寡核苷酸序列,对其3’-末端用地高辛标记后,作为探针与不同种的双歧杆菌DNA进行膜杂交。实验结果显示,这5个寡核苷酸探针除婴儿双歧杆菌种特异的探针PIN-DIG与短双歧杆菌有较弱的交叉反应外,其余均表现出较好特异性,说明这些16srRNA基因探针对于食品中双歧杆菌的鉴定和检测是一个特异且有效的工具。     

新疆喀什地区维吾尔族母乳源双歧杆菌分离筛选及其益生特性分析

采用多重聚合酶链式反应指纹图谱结合16S rRNA基因测序技术对新疆喀什地区维吾尔族母乳分离的双歧杆菌进行鉴定和遗传差异分析,并检测常规生理生化和糖代谢表型特征,同时测试菌株对6 种常见病原菌和3 种母乳源条件致病菌的抑菌性能和对胃肠液的耐受性。结果显示,15 份母乳样品中共分离15 株双歧杆菌,测序结果将菌株归属于3 个种以及2 个亚种,包括8 株假小链双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、2 株短双歧杆菌（B. breve）、2 株长双歧杆菌长亚种（B. longum subsp. longum）和3 株长双歧杆菌婴儿亚种（B. longum subsp. infantis）。抑菌实验表明,15 株测试菌株中,隶属于B. pseudocatenulatum的4 株菌MY92、MY75-1、MY72、MY81的抑菌谱更广,抑菌能力更强;胃肠液耐受性实验表明菌株MY92无论在模拟胃液还是模拟肠液中存活率均最高,分别达到20.37%和0.302%。基于以上描述特性,MY92作为一株有效的益生菌株,具有潜在的利用价值,为后期进一步作为防止婴幼儿腹泻辅助制剂的开发提供参考。