重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外.重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积...     

一种高耐热普鲁兰酶的克隆表达、酶学性质及其在粉丝制作中的应用

为了获得一种适合在粉丝制作中使用的高耐热普鲁兰酶,对Thermus thermophilus的普鲁兰酶基因进行了异源表达及应用性质研究。以T.thermophilus XQ5331基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增获得普鲁兰酶编码基因TtP5331,在大肠杆菌中实现高效表达。重组酶TtP通过离子交换层析获得初步纯化。酶学性质研究结果显示,重组酶最适作用温度为75℃,最适pH6.5,在最适条件下比酶活为17 U/mg。重组酶TtP在90℃下保温10 min仍能保留约60%的酶活,沸水浴5 min可以完全灭活。在传统粉丝制作工艺基础上,采用先加酶后制芡糊的方式制作粉丝,按照每克芡糊淀粉1 U的量添加TtP处理芡糊,制作的粉丝的断条率为4.5%,与添加明矾获得的粉丝基本一致。以上结果说明,在酶法粉丝制作工艺中,TtP适合在芡糊制作前在淀粉悬液中添加,是一种用量小、使用简便的明矾替代物。     

启动子替代构建克雷伯氏菌普鲁兰酶高产菌株

应用启动子替代技术将普鲁兰酶产生菌克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HN9的普鲁兰酶基因的启动子替换为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的P43启动子,构建高产酶菌株。通过融合PCR,将由3个DNA片段融合得到启动子替代同源重组片段,该3个DNA片段分别是带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因启动子上游部分同源序列的四环素抗性基因(Tet)的上游片段Tet1、带有枯草芽孢杆菌P43启动子部分上游同源序列的Tet下游片段Tet2和带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因上游同源序列的P43启动子部分序列的Pro。经电转化将同源重组片段导入克雷伯氏菌中,转化子的普鲁兰酶基因表达水平比出发菌株提高10.23~11.45倍,摇瓶发酵酶活力提高8.97~10.52倍。结果表明,应用高效组成型启动子P43替代原始菌株的普鲁兰酶基因的启动子能够显著提高普鲁兰酶基因的表达量和发酵酶活力。     

重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

产谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建与食品级表达

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶。本研究构建了4株无抗标记的重组枯草芽孢杆菌,首次实现了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis IL 1403)来源的谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的食品级表达。通过比较4株重组枯草芽孢杆菌的生长曲线和发酵酶活曲线,筛选出产酶效率最高的重组菌株B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal,该重组菌在初始发酵培养基中发酵42 h后发酵酶活可达4.1 U/mL。通过调整培养基成分,重组菌B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal的发酵酶活最高达到7.4 U/mL,与初始相比酶活提高了79%,是目前已报道重组枯草芽孢杆菌产谷氨酸脱羧酶酶活的最高水平。     

一种中性普鲁兰酶及其在红薯粉丝制作中的应用

本研究旨在开发一种在较宽泛的pH范围内活性稳定的中性普鲁兰酶,以适应以红薯面为原料的粉丝制作工艺。以地表地芽孢杆菌（Geobacillus subterraneus） XQ3665基因组DNA为模板,经PCR扩增得到普鲁兰酶基因pul3665,并实现了异源表达。重组酶PUL3665纯酶比酶活为32 U/mg,最适反应温度55 ℃,最适pH为6.5,在pH 5.5~7.5 范围内酶活保持在最高酶活的80%以上。PUL3665降解普鲁兰多糖的产物为麦芽三糖,不降解可溶性直链淀粉,是一种I型普鲁兰酶。在以不同pH值的红薯面为原料的粉丝制作工艺中,按每克芡糊淀粉2 U的量添加枯草芽孢杆菌表达的PUL3665粗酶液处理芡糊,均能在不添加明矾或其它添加剂的条件下制作出粉丝,且成品粉丝质量与添加明矾获得的粉丝基本一致。PUL3665有希望开发成一种用量小,使用效果稳定的新型明矾替代物。