磷脂酶D特性及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）是一种新资源食品,在自然界中含量稀少,提取困难。磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）是生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的关键合成酶。本文主要介绍了PLD的分子结构特点、催化机理及酶活特性,并总结了目前PS的制备方法,重点对PLD酶催化制备磷脂酰丝氨酸的研究进展及反应体系进行了论述,并对催化制备PS反应体系的选择进行了分析和展望,以期为深化酶法技术制备PS的研究提供参考,以此推动新资源食品PS的工业化生产和应用。     

磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺研究

本文研究了磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺,实验结果表明有机相和水相比例、磷脂酰胆碱(PC)浓度、反应温度、水相pH以及反应时间都对磷脂酰丝氨酸的制备有一定的影响。通过正交实验优化利用磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的最佳工艺为:有机相和水相的比例为4/4、PC浓度为75mg/mL、反应温度为40℃、水相pH值为4.0、反应时间为12h,在此工艺条件下磷脂酰丝氨酸得率为:68.9%。     

磷脂酶D的制备及催化磷脂酰胆碱合成磷脂酰丝氨酸

选用穗色链霉菌(Streptomyces racemochromogenes)作为磷脂酶D的生产菌株进行了酶的制备及条件优化,并在两相体系中进行了酶催化磷脂酰胆碱合成磷脂酰丝氨酸的研究。结果表明,最适的产酶条件为葡萄糖10 g/L、酵母粉5 g/L、鱼粉蛋白胨5 g/L、司班-60 10 g/L、氯化钙3 g/L,接种量1%、培养基初始p H 7.0、培养温度30℃,在最适产酶条件下酶活达到2 967 U/L,是优化前的2.12倍;最适的催化工艺条件为有机相二氯甲烷、反应温度35℃、p H 5.5、酶用量1.15 U/m L、钙离子浓度10 mmol/L,在该催化工艺条件下反应10 h后磷脂酰胆碱的生成率达94%。     

磷脂酶D的纯化及催化制备磷脂酰丝氨酸研究

采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶层析对广岛链霉菌SK43.001-11发酵液中的磷脂酶D进行纯化,并对双液相体系中酶法制备磷脂酰丝氨酸的工艺进行研究。结果表明,纯化后,磷脂酶D比酶活提高到49.48 U/mg,是粗酶液的54. 37倍,回收率为32.31%。磷脂酶D双液相催化制备磷脂酰丝氨酸的最佳条件为:有机相为乙醚,pH6.5,反应温度30℃,L-丝氨酸与磷脂酰胆碱质量比15∶1,有机相与水相体积比1∶1,反应时间2.5h。在最佳条件下,磷脂酰丝氨酸生成率达到74.8%。     

磷脂酶D单一水相法催化合成磷脂酰丝氨酸工艺研究

研究了磷脂酶D单一水相法催化合成磷脂酰丝氨酸(PS)的工艺,单因素实验结果表明,用水量以及粗大豆磷脂(磷脂酰胆碱:25%)的比例、L-丝氨酸用量、反应温度以及反应时间都对磷脂酰丝氨酸的制备有一定的影响。通过正交实验优化利用单一水相法通过磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的最佳工艺参数如下:用水量-粗大豆磷脂的比例为2:1、丝氨酸浓度为0.6g/m L、反应温度为50℃以及反应时间为30h。在此工艺条件下在该工艺条件下主要通过减少水的用量以及增加丝氨酸的用量能够有效克服单一水相法的缺点,抑制磷脂酶D的水解活性,最终使反应体系中磷脂酰丝氨酸的含量为15.78%,PS的转化率约为63.12%。该工艺相比有机溶剂-水双相反应更具优势,在此基础上,该工艺有望通过进一步的研究以提高反应过程中PS的转化率。     

蛋白质工程改造磷脂酶D提高磷脂酰丝氨酸产量

为了进一步提高磷脂酰丝氨酸(PS)产量,将来源于Streptomyces katrae的野生型磷脂酶D(SkPLD)于E.coli BL21(DE3)中进行异源表达,获得菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SkPLD,以磷脂酰胆碱(PC)和L-serine为底物,发现限制PS产量进一步提高的限制因素是转磷脂酰反应转化率低(<35%)而水解反应转化率过高(>30%)。在对SKPLD结构进行详尽分析的基础上,通过蛋白质工程改造策略扩大底物催化通道,降低位阻效应;同时提高His462与L-serine的亲和力,降低水解反应。结果表明,获得4个有益单突变体(Y405A、Q407G、D370P、K478P),对其进行组合突变,获得四突变体SkPLD^{Y405A/Q407G/D370P/K478P},转化率、PS产量、k_cat/K_m分别为55.6%、42.3 g·L^-1、1.53(mmol/L)^-1s^-1,比野生型分别提高了59.8%、59.6%、93.7%。PS产量进一步提高的原因在于四突变体催化腔体积扩大到718.6 ų,且His462 N原子与L-serine O原子的催化距离(d1)缩短0.6 Å,与H₂O O原子的距离(d2)增加0.8 Å。在3 L规模转化体系中,PS产量为50.4 g·L^-1、转化率达到66.3%,时空产率为12.6 g/L/h。本研究利用蛋白质工程改造获得了转磷脂酰活性提高的突变体,为提高磷脂酶D的工业生产奠定了坚实的基础。     

Streptomyces septatus磷脂酶D在毕赤酵母中的重组表达及酶学性质分析

以Streptomyces septatus TCCC 21057基因组为模板,扩增得到磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因(pld),经合成获得pld密码子优化基因(pldm),以pPIC9K为表达载体,毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为宿主菌株,构建获得毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-pldm,摇瓶发酵后获得的重组PLD(rPLDM)转酯活力达2.37 U/mL;rPLDM经纯化后进行转酯酶学性质分析,其最适作用温度为60℃,最适作用pH值为6.5;在单水相反应体系中,40℃、pH 6.5、Ca²⁺浓度10 mmol/L、大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸物质的量比1∶10、rPLDM添加4.0 U/mL,反应6 h后,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的产率可达到33%。本研究通过对rPLDM的重组表达、转酯酶学性质及催化合成PS的研究,为进一步实现酶法合成新资源食品PS奠定了基础。     

磷脂酶D催化高温降解后大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸工艺研究

研究以粗大豆卵磷脂为原料,经过高温降解后采用含磷脂酶D发酵液催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺。为了确定高温降解粗大豆卵磷脂的最佳工艺,设计了相应的正交试验。结果表明,通过正交试验优化,以1倍体积水饱和的乙酸丁酯为溶剂,127℃降解40 h能够有效改变粗大豆卵磷脂中其他磷脂的结构和化学性质,有利于磷脂酰胆碱的进一步纯化。通过甲醇提纯后进一步通过磷脂酶D发酵液催化合成磷脂酰丝氨酸,最后采用无水乙醇作为产品的提纯溶剂进行分离纯化,最终得到磷脂酰丝氨酸含量为48.45%的产品。     

磷脂酰丝氨酸研究进展

综述了磷脂酰丝氨酸的结构、合成机理及其在改善老年人阿耳茨海默(氏)病、提高认知力、抗抑郁、缓解紧张压抑、辅助激活酶等方面的保健功效,同时对磷脂酰丝氨酸在食品、药品行业的应用前景进行了展望。      

生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的研究进展

近年来的研究表明,磷脂酰丝氨酸具有预防老年痴呆症、改善记忆力等功能。但是天然存在的磷脂酰丝氨酸很少,提取工艺繁杂,并且产品安全性受到人们质疑。生物酶法制备磷脂酰丝氨酸具有反应条件温和、环境友好、产品质量好等优点,近年来受到越来越多的关注。从用于生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的酶和反应体系等方面综述了国内外生物酶法制备磷脂酰丝氨酸的相关研究进展,并指出开发稳定高效的酶制剂和探寻绿色安全的新工艺等措施有助于促进生物酶法工业化生产磷脂酰丝氨酸。     

产气荚膜梭菌磷脂酶C的重组表达及其脱胶应用

将产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)磷脂酶C(Cp-PLC)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了重组表达,并对重组Cp-PLC表达条件进行了优化。结果表明:当菌体生长至OD600为1.0时,添加8 g/L乳糖在30℃下诱导32 h,得到的重组Cp-PLC的酶活最大,为398.35 U/mL;重组Cp-PLC用于菜籽毛油脱胶的最佳条件为温度57℃、pH 5.0、加酶量600 U/kg、反应时间1.5 h;在最佳条件下,菜籽毛油的磷含量可降至5.66 mg/kg,能够满足物理精炼的要求。     

金黄色葡萄球菌磷脂酶C克隆表达及其脱胶应用

该实验对金黄色葡萄球菌磷脂酶C(phospholipase C,PLC)基因在大肠杆菌(E.coil BL21(DE3))中进行重组表达。通过发酵优化,最终在30℃条件下,利用0.001 mmol/L IPTG诱导表达10 h,重组酶活达到47.4 U/mL。利用该重组PLC对大豆毛油进行脱胶处理,确定了最佳脱胶条件为:50℃、1 200 U/kg油、pH 4.7,反应时间2 h,最终可使大豆毛油中磷含量从266 mg/kg降低至3.5 mg/kg,能够完全满足物理精炼要求。金黄色葡萄球菌磷脂酶C的重组表达及其在大豆毛油的脱胶应用为酶法脱胶技术的开发提供了理论支持。     

Thermobifida fusca麦芽三糖淀粉酶的重组表达及其在麦芽三糖制备中的应用

麦芽三糖淀粉酶以淀粉或麦芽糊精为原料,可生产麦芽三糖,在食品、饮料等行业具有广泛的应用前景。实验将Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌WS11中进行重组表达,并进行酶学性质分析,重组酶的最适温度和pH分别是55℃和6.0。在此基础上探究了重组酶作用于麦芽糊精生产麦芽三糖的最佳条件。结果表明,以15%浓度的麦芽糊精(DE 5-7)作为底物时,酶转化的最佳条件是温度55℃、pH 5.5、加酶量60 U/g(底物)、普鲁兰酶加酶量32 U/g(底物)、反应时间11 h,此时得到麦芽三糖转化率44.4%。该研究为工业制备麦芽三糖提供了理论依据。     

Thermus thermophilus分支酶的重组表达及其在抗性糊精制备中的应用

本文研究了来源于Thermus thermophilus的淀粉分支酶TtSBE,通过基因工程的方法构建重组大肠杆菌E.coli BL21（PET-24（a+）-TtSBE）,使之在大肠杆菌内高效表达,并在此基础上对TtSBE的酶学性质进行研究,结果表明,TtSBE的最适pH为6.5,最适温度为60℃,在60℃的半衰期为40 h左右,TtSBE经纯化后,比活为773.27 U/mg;以2%的焦糊精为底物,利用TtSBE制备抗性糊精,当酶转化温度为60℃,pH为6.5,加酶量为3000 U/g（焦糊精）,酶转化时间为12 h时,抗性成分含量达到50%,较焦糊精原料中的抗性成分含量提高了7%,本研究为抗性糊精的产率和质量的进一步提高奠定了基础。      

磷脂酶D及非水相应用进展

介绍了磷脂酶D(PLD)的结构、活性影响因素及在非水相中的应用进展.     

单增李斯特氏菌磷脂酶C(lm-plcB)基因的克隆表达及其在油脂脱胶中的应用

在大肠杆菌中克隆表达单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)磷脂酶C,并进行发酵优化。当接种量为4%时,37℃,200 r/min培养2 h后添加2.5 g/L乳糖,25℃摇瓶诱导发酵26 h,最终获得重组磷脂酶C的活力达到754.6 U/mL。利用该重组磷脂酶C对大豆毛油和菜籽毛油进行脱胶,精炼油中的含磷量分别从216.67mg/kg和183.70 mg/kg下降到3.70 mg/kg和4.50 mg/kg,说明该重组磷脂酶C能够用于不同植物毛油脱胶,可以达到后续精炼工艺要求,同时增加毛油精炼率,在油脂脱胶工艺方面具有较大的应用前景。