重组Cystatin对冷藏鲢鱼的抑菌效果

分离鉴定4℃有氧冷藏鲢鱼去皮肉片货架期终点腐败相关优势假单胞菌,并研究鲢鱼重组Cystatin(家族Ⅱ)对优势腐败假单胞菌的抑菌效果。首先利用CFC培养基从4℃有氧冷藏鲢鱼去皮肉片货架期终点,分离筛选出腐败相关假单胞菌,并采用生理生化和16 SrDNA法对其进行鉴定,其次将腐败菌株进行回接试验,通过测定各腐败菌回接组的挥发性盐基氮(TVB-N)值、菌落数、感官评分判断其致腐能力。最后,采用滤纸片扩散法和营养肉汤法鉴定重组鲢鱼Cystatin (家族Ⅱ)对优势腐败假单胞菌的抑菌效果。结果表明,荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)和草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)为主要致腐菌,所占比例分别为63.3%、26.7%,且荧光假单胞菌致腐能力强于草莓假单胞菌。重组Cystatin对两种菌均有明显的抑菌效果,且呈剂量依赖关系。     

鲢鱼重组Cystatin及其酶解产物对草鱼冷藏肉片优势腐败菌的抑制作用

首先通过三羟甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)和滤纸片法分别鉴定木瓜蛋白酶液(Papain)对鲢鱼重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)酶解程度及酶解产物对草鱼冷藏肉片中分离的3种优势腐败菌,即草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)和中间气单胞菌(Aeromonas media)的抑菌活性。结果表明,酶解6 h后的产物,即9.5 ku以下的片段对3种菌的抑菌效果均最好。再利用凝胶过滤高效液相色谱(TSK-GEL G2000SWXLHPLC)和双向电泳对6 h酶解产物进行分离纯化分析。发现仅峰T-2对3种菌均具有明显的抑制活性,峰T-2在TSK-GEL G2000SWXLHPLC上呈现单一峰,电泳得到单一蛋白点,其分子质量为8.6 ku,p I值为6.5。最后通过RPLC-MS/MS串联质谱鉴定该蛋白点,得到3个肽片段(31QSNDAFVR38、46VQQQVAAGMKY56和81NPSIEQVIQ89)且含有Cystatin特征序列QVAAG。结果提示,Cystatin蛋白(完整序列分子质量12~14 ku)内部,存在能够发挥抑菌作用的肽片段。     

柠檬烯对铜绿假单胞菌的抑菌活性及其机理

以铜绿假单胞菌为供试菌,研究了柠檬烯对铜绿假单胞菌的抑菌活性及机理。利用肉汤稀释法测定了最小抑菌浓度(MIC),评价了柠檬烯抑菌活性,通过细菌生长曲线的测定、扫描电镜观察、细胞膜通透性以及膜电位的测定,诠释柠檬烯对铜绿假单胞菌的抑菌机理。结果表明:柠檬烯能抑制铜绿假单胞菌的正常生长和增殖,最小抑菌浓度为10 mL/L;柠檬烯可以破坏细胞的正常形态,提高菌液的相对电导率,增加细胞膜的通透性;柠檬烯也能降低铜绿假单胞菌菌体的膜电位,干扰细胞正常代谢活动。柠檬烯通过破坏细菌细胞膜的方式,抑制铜绿假单胞菌生长,导致细菌细胞死亡。这说明柠檬烯可以改变铜绿假单胞菌细胞膜的通透性,破坏其正常细胞形态结构及完整性,从而有效地抑制铜绿假单胞菌的正常生长。     

鲶鱼体表粘液粗提物对铜绿假单胞菌的抑菌机理初探

本文以铜绿假单胞菌为研究对象,探讨鲶鱼体表粘液提取物(Catfish Epidermal Mucus Extracts,CEME)对其的抑制效果及抑菌机理。研究表明:当CEME浓度高于0.15%时,鲶鱼体表粘液提取物对铜绿假单胞菌有显著的抑制作用,通过测定微生物的生长曲线可以看出CEME能够有效减缓铜绿假单胞菌的生长速率。进一步使用扫描电镜发现CEME对铜绿假单胞菌的细胞形态结构能够造成明显的损伤,有效破坏微生物细胞膜的完整性。同时CEME还可以导致铜绿假单胞菌细胞膜的通透性增加,从而导致体内小分子物质以及部分大分子物质向外泄漏。应用SDS-PAGE方法发现CEME处理对铜绿假单胞菌的总蛋白和细菌膜蛋白均有显著的影响,它能够抑制菌体某些蛋白的合成,导致胞内蛋白含量的下降和缺失。上述研究结果表明鲶鱼体表粘液提取物对铜绿假单胞菌有较好的抑制效果。     

黑胡椒石油醚相提取物对铜绿假单胞菌的抑制机理

以铜绿假单胞菌为供试菌,探究黑胡椒石油醚相提取物对铜绿假单胞菌细胞壁、细胞膜和Na+/K+-ATPase活性的影响,初步揭示黑胡椒石油醚相提取物抑菌机理。研究结果表明:黑胡椒石油醚相可抑制铜绿假单胞菌的正常生长,最小抑菌质量浓度为1.25 mg/mL。经提取物作用后铜绿假单胞菌大量死亡,细胞壁完整性被破坏,ALP-ase外渗;而细胞膜渗透性损坏,Na+/K+-ATP-ase活性显著降低,铜绿假单胞菌细胞形态发生变化。黑胡椒石油醚相提取物能破坏铜绿假单胞菌的正常细胞形态,抑制相关酶活性,从而抑制铜绿假单胞的正常生长。     

抗铜绿假单胞菌南极微生物的筛选、鉴定及其抑菌谱研究

该研究采用稀释涂布平板法从南极团结湖沉积物中分离、纯化南极微生物,采用双层平板法和琼脂扩散法从中筛选铜绿假单胞菌的拮抗菌,通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析对筛选菌株进行菌种鉴定,并测定其抑菌谱。结果表明,共分离纯化出64株南极微生物,8株对铜绿假单胞菌具有抑制作用,其中菌株NO.TJ31的抑制效果最好,抑菌圈直径达（22.3±0.7） mm,经鉴定,其为弗氏甲基杆菌（Methylobacterium frigidaeris）,菌株NO.TJ31对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯氏菌都具有一定的抑制作用,具有较广的抑菌谱。     

银杏种仁蛋白分离纯化及其抑菌活性

从银杏种仁中分离纯化具有抑菌活性的蛋白质,并分析其抑菌活性。结合抑菌活性分析,采用硫酸铵分级盐析、透析、纤维素DE-52阴离子交换柱层析及Sephadex G-75凝胶过滤柱层析对银杏种仁蛋白（Ginkgo bilobaseed protein,GBSP）进行分离纯化,得到一种抑菌蛋白GBSPⅠ-A。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）检测结果显示,该蛋白呈单一条带,其分子质量约为42.80 kD;Superdex G-75柱层析结果显示GBSPⅠ-A呈单一对称峰,高效凝胶渗透色谱测定其分子质量为39.32 kD;该蛋白对肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、戴尔有孢圆酵母及黑曲霉的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）分别为20、20、20、12 mg/mL。     

大头金蝇幼虫抗菌肽提取纯化及抑菌活性研究

目的:从大头金蝇幼虫中分离纯化天然抗菌肽,并检测抗菌肽的抑菌活性。方法:提取大头金蝇幼虫抗菌肽,粗提物经凝胶过滤色谱、阳离子交换树脂、反相色谱纯化,纯化产物检测其抑菌活性并利用GFC-HPLC测定其分子量。结果:最终纯化出一个活性组分,该组分对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为20.40μg/m L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2.04 mg/m L,对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.17 mg/m L;该活性组分分子量大小为2570 u。结论:该抗菌肽组分对铜绿假单胞菌有较强抑菌活性,有较好的开发利用价值。     

金银花提取物对冷却肉中假单胞菌黏附性的影响

研究冷却肉中假单胞菌的黏附能力及金银花提取物的降黏附效果。结果表明：从15 份市售冷却肉中分离 得到46 株假单胞菌,经16S rDNA结合VITEK 2系统鉴定为恶臭假单胞菌22 株,占47.8%;荧光假单胞菌10 株,占 21.7%;铜绿假单胞菌6 株,占13.0%;浅黄假单胞菌8 株,占17.4%;33 株（71.7%）假单胞菌具有黏附能力,具有 强黏附能力的菌株占17.4%,其中恶臭假单胞菌数量最多;金银花提取物能够降低4 种假单胞菌的黏附能力,且对 恶臭假单胞菌5-3和铜绿假单胞菌5-1作用效果更强,作用效果与金银花提取物质量浓度有关;金银花提取物质量浓 度高于最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）时,主要通过抑制菌体生长、减少胞外多糖产 生而降低假单胞菌的黏附能力;金银花提取物质量浓度低于MIC时,主要通过溶解菌体胞外多糖、增强通透性、降 低均匀度而降低假单胞菌的黏附能力。     

黄芩、黄连水提物对常见临床耐药菌株的作用研究

目的检测黄芩、黄连水提物对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌耐甲氧西林株(MRSA)、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌4种常见临床耐药菌的抑菌活性。方法依据NCCLS相关标准,采用微量肉汤稀释法检测抑菌活性。结果黄芩和黄连水提物及有效成分对金黄色葡萄球菌及MRSA抑菌效果较为显著,对大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌效果次之,对铜绿假单胞菌效果最弱;不同比例混合物中,以黄芩、黄连比例为1:2时效果最好。结论不同比例提取物混合物对MRSA均有较好的抑菌效果,对铜绿假单胞菌的抑菌效果则相对较弱。建议临床应用于抑菌时,黄芩、黄连混合比例为1:2。     

山西老陈醋类黑精的分离及其抑菌活性

为探究老陈醋类黑精的抑菌作用,采用超滤和尺寸排阻色谱法将山西老陈醋冻干粉（Shanxi aged vinegarextract,SAVE）分离成不同分子质量的水提物和类黑精部分,采用NaCl解离法将醋类黑精解离为类黑精骨架和小分子复合物两部分,用比浊法测定各组分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性。结果表明：SAVE中的类黑精具有显著的抑菌活力（P＜0.05）,类黑精对SAVE的抑菌性发挥了主要作用;类黑精中分子质量在3～5 kD的组分抑菌活力最强,其对3 种受试菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）均为5 mg/mL;类黑精组成中的小分子复合物比类黑精骨架部分具有更强的抑菌活性。     

牛肾溶菌酶的分离纯化及部分酶学性质

将新鲜牛肾匀浆后,经由缓冲液提取,正丁醇除脂,硫酸铵分级沉淀,CM-Sepharose阳离子交换层析,Superdex-200凝胶过滤层析后得到电泳纯的牛肾溶菌酶。结果表明：该酶比活力为15 145.63 U/mg,回收率为29.13%,纯化倍数为231.05;分子质量约12.66 kD,为单亚基酶。最适反应温度为65 ℃,在65 ℃以下较稳定;最适pH 9.0,pH值在3.0～9.0范围内稳定性较好;测得最适条件下牛肾溶菌酶对溶壁微球菌的Km值为0.399 μg/mL;甲醇、乙醇、异丙醇和硫氰化钾（KSCN）对该酶有激活作用;十二烷基硫酸钠、Pb2＋、Ag＋对该酶有明显抑制作用。     

苦荞凝集素的纯化及性质鉴定

目的：从苦荞麦种子中提取、纯化苦荞凝集素,对其凝血及酶学活性等性质进行初步研究。方法： 采用缓冲液抽提、硫酸铵沉淀、透析及DEAE-纤维素阴离子交换层析（DEAE fast flow,DEAE FF）纯化凝集素;高碘酸希夫（periodic acid-Schiff,PAS）染色鉴定其蛋白种类,硫酸-苯酚法测定糖含量;凝血实验和糖抑制实验检测其凝血活性和结合糖特异性;以对硝基苯磷酸二钠为底物,测定磷酸酯酶活性。结果：从苦荞麦种子中获得了一种具有凝血功能的蛋白质--苦荞凝集素（tartary buckwheat lectin,TBL）。纯化的TBL在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）图谱上显示单一条带,根据SDS-PAGE计算其分子质量约为62 kD。PAS染色证明TBL为糖蛋白,糖含量为5.8%。凝血实验表明TBL对人的O型血红细胞具有特异性凝集作用,效价为15 μg/mL,对其他血型的红细胞没有凝血效应。血凝活性被D-甘露糖和D-葡萄糖抑制,推测其是一种甘露糖结合凝集素。酶学性质鉴定显示,TBL具有磷酸酯酶活性,米氏常数Km= 9.86×10－3 mol/L。结论：TBL可能是苦荞麦种子中的一种具有多种酶学功能的甘露糖凝集素     

鸭肝乳酸脱氢酶的分离纯化及部分性质研究

新鲜鸭肝经匀浆、磷酸盐缓冲液抽提,乙醇和硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乳酸脱氢酶。该酶经纯化后酶比活力达到668.82 U/mg,酶活回收率为25.79%,纯化倍数为185.78。该酶的全分子质量约为170.93 kD,亚基分子质量为44.72 kD;最适反应温度为45 ℃,最适pH值为7.4,在25～45 ℃及pH 5～10的范围内稳定性较好;在45 ℃、pH 7.4条件下,测得该酶对底物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,NADH）的Km值为3.407 μmol/L,对丙酮酸钠的Km值为8.431 μmol/L;草酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Co2＋、K＋对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用,而高浓度时具有抑制酶活性的作用。     

杂优-2平菇漆酶的分离纯化及酶学性质

将杂优-2平菇菌丝进行液体培养,发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fastflow层析和Superdex-200 prep grade层析等方法纯化,获得了电泳纯的杂优-2平菇漆酶,并对纯化的漆酶进行了部分酶学性质研究。结果显示,杂优-2平菇漆酶比活力为115 U/mg,分子质量约为244.0 kD,亚基分子质量约为85.6 kD。最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55 ℃,在pH 6.0～8.0及40～55 ℃范围内稳定性较好;最适条件下,以2,2’-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）为底物的Km值为2.1 mmol/L,最大反应速率（vmax）为0.117 μmol/（min·L）。Fe2＋、抗坏血酸对该酶活性具有完全抑制作用,乙二胺四乙酸、Ag＋、Mg2＋、Li＋对该酶活性影响较小;草酸、甲醇、正丁醇、K＋、Ca2＋、Ba2＋、Zn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Mn2＋、Co2＋对该酶活性有不同程度的抑制作用;Cu2＋激活作用不明显;尿素、乙醇、异丙醇对该酶活性具有激活作用。     

仿刺参体壁中抗菌肽的分离及抑菌活性

从仿刺参体壁中分离纯化出抗菌肽并研究其抑菌活性。以鲜活仿刺参体壁为原料,采用5%乙酸浸提法进行粗提,以抑菌活性为指标进行分离。经超滤系统超滤,大孔吸附树脂柱层析分离纯化,采用酶标仪比浊法检测各组分对大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、肠炎沙门氏菌（Salmonella eternitidis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性。采用Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,Tricine-SDS-PAGE）检测抗菌肽分子质量。结果表明：通过超滤分离,分别得到分子质量＜1、1～5 kD和5～10 kD组分,其中分子质量＜1 kD组分的抑菌活性最高,选用该组分继续进行大孔吸附树脂柱层析分离,得抑菌活性最高的组分,其Tricine-SDS-PAGE结果表现为单一条带,分子质量约为4.35 kD。     

单环刺螠体壁多糖的分离纯化、理化性质及抗脂质过氧化活性

为研究和开发单环刺螠中活性多糖成分,采用酶法提取和色谱分离技术,从单环刺螠的体壁中提取分离多糖组分,采用化学和仪器分析方法对其单糖组成、分子质量等理化性质进行研究,并通过体外清除脂质过氧化物实验对其进行初步的活性评价。结果表明：采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶两步酶解后,单环刺螠多糖（unicinctus polysaccharide,UP）得率为5.3%。通过离子交换柱层析分离纯化后主要得到两个组分UP-1和UP-2。UP-1是主要由葡萄糖（Glc）组成的高聚葡聚糖,分子质量340 kD,而UP-2为组成复杂的类糖胺聚糖,分子质量约为7.9 kD,主要含有葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、氨基葡萄糖（GlcN）和岩藻糖（Fuc）,还含有少量的甘露糖（Man）和氨基半乳糖（GalN）。其单糖组成Man、GlcN、GalN、Glc、Gal、Fuc物质的量比例为1.0∶1.47∶0.64∶6.49∶2.5∶3.0。和其他海洋动物来源类糖胺聚糖类似,UP-2还含有少量的硫酸基,含量为7.4%。对UP-1和UP-2进行初步体外抗氧化活性研究表明,类糖胺聚糖UP-2具有显著的脂质过氧化物清除活性,半数清除质量浓度为5.0 mg/mL。     

苦荞10 kD过敏原的重组表达及部分性质分析

以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞10 kD过敏原基因序列TBAP10（tartary buckwheat 10 kD allergenprotein,TBAP10;GenBank登录号JK729379.1）为基础,构建重组表达载体pET47b-TBAP10,重组蛋白在大肠杆菌BL21 Star（DE3）中以包涵体形式表达。经包涵体复性和钴离子螯合层析纯化目的蛋白,并对其过敏活性、热稳定性及在模拟胃肠环境中的稳定性进行了分析。Western blotting显示该蛋白与苦荞16 kD过敏蛋白Fag t2存在免疫交叉反应。竞争性ELISA证明重组蛋白TBAP10具有与荞麦过敏患者血清IgE特异的结合活性;TBAP10具有强的热稳定性,能耐受15 min的沸水浴;模拟胃肠环境的消化结果显示TBAP10对胃蛋白酶具有强的耐受性,但对胰蛋白酶无耐受性。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。