两种漆酶改性方法及其在造纸纤维改性中的应用

由于漆酶在高温和其它极端环境下不稳定、易失活,使漆酶改性纤维的条件受到一定限制。因此,有必要对漆酶进行一定的改性处理,使其活性、稳定性提高。本文基于漆酶氨基酸残基末端的活性基团氨基(-NH2)和羧基(-COOH)分别与二氧化硫脲和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐发生反应使漆酶活性、稳定性提高的改性方法。通过研究发现,L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐改性后的漆酶和二氧化硫脲改性后的漆酶活性分别提高209%、50%,稳定性前者提高50%,后者变化不大。将改性漆酶/组氨酸用于OCC浆,添加L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐改性漆酶/组氨酸的纸张比添加未改性漆酶/组氨酸的纸张抗张强度、耐破度以及撕裂度分别提高13%、10%、9%;添加二氧化硫脲改性漆酶/组氨酸的纸张比添加未改性漆酶/组氨酸的纸张抗张强度、耐破度以及撕裂度分别提高5%、7%、6%。因此,用二氧化硫脲和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐改性漆酶方法可行,漆酶活性和稳定性均得到较大提高。     

Coprinopsis cinerea 漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

本文通过RT-PCR从Coprinopsis cinerea okayama7#130中克隆得到laccase1,应用SignalP3.0Server软件分析其氨基酸序列后设计不含信号肽序列的新引物扩增得到不含信号肽的漆酶基因1（lac1）,并构建重组酵母表达载体pPIC9K-lac1,电击转化毕赤酵母GS1115并用甲醇诱导表达,之后研究重组酶的酶学性质。克隆得到的laccase1全长为1593bp,编码530个氨基酸,其中信号肽包含18个氨基酸。SDS-PAGE显示重组蛋白大小约为65KDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,最适pH为4.3。重组漆酶在45℃保存3h后活性基本保持不变,在pH4.0～10.0的范围内稳定性较好。成功分泌表达的漆酶活力达到1.108U/mL。     

嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC的克隆及组氨酸融合酶蛋白的表达

应用PCR扩增嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC,重组至原核表达载体pET30b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达的重组乙醛脱氢酶在碳端含有一个组氨酸标签。SDS-PAGE考察蛋白的表达量和亚基分子量,并对Km值进行了考察。成功构建了pET30b-aldC原核表达质粒;诱导表达了亚基分子量约为56 kDa的组氨酸融合蛋白;乙醛脱氢酶活性比对照菌增加了约3.5倍;Km值为2.874 mmol/L。成功克隆并诱导表达了含组氨酸标签的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC。     

麻痹性贝类毒素受体蛋白Saxiphilin的克隆与表达

目的麻痹性贝类毒素受体蛋白Saxiphilin可特异性结合麻痹性贝类毒素,本文采用杆状病毒表达载体系统对Saxiphilin进行体外表达研究。方法从牛蛙肝脏克隆得到ssziphilin基因(N端含有自身分泌信号肽),利用特异引物使其C端带上组氨酸标签。结果使用杆状病毒表达载体系统构建带有目的基因的重组病毒,用病毒感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞Sf9以表达Saxiphilin,通过优化细胞培养基中胎牛血清含量及感染时间,确定使用无血清培养基培养,重组病毒感染Sf9细胞72 h时,培养基中可溶性目的蛋白表达量最大。结论通过镍柱纯化得到Saxiphilin蛋白,以期将此蛋白进一步用于麻痹性贝类毒素的检测。     

重组短小芽孢杆菌CotA漆酶的酶学性质及发酵优化研究

细菌漆酶具有良好的热稳定性和抗碱性环境能力,在工业废水处理和染料脱色方面具有很大的潜力。通过研究短小芽孢杆菌W3菌株的CotA漆酶基因在大肠杆菌中重组表达的酶学性质,对其发酵培养基进行优化,以提高产量。利用分子手段实现CotA漆酶基因在大肠杆菌中的重组表达,并利用BP神经网络建模和萤火虫算法寻优对CotA漆酶发酵培养基进行优化,最后重组表达的CotA漆酶进行染料脱色研究。结果表明,重组菌株表达的CotA漆酶具有良好的热稳定性和耐碱能力,最适反应pH值为3.5,最适反应温度为80 ℃。重组CotA漆酶对底物ABTS具有良好的亲和能力,Km为0.247 mmol/L,Kcat为41.32 s ^-1。在适宜条件下的重组CotA漆酶的表达量为1 915.3 U/L,使用BP神经网络和萤火虫算法优化培养基获得最佳的发酵培养基配方为：蛋白胨1.16 g/dL、酵母粉0.428 g/dL、NaCl 1.06 g/dL、CuSO ₄ 0.274 mol/L和甘油（体积分数）0.931%。优化过的培养基产CotA漆酶酶活为3 088.68 U/L,相比未优化之前提高了61.26%。重组表达的CotA漆酶对孔雀石绿和酸性蓝129脱色效果明显,达到90%脱色率。短小芽孢杆菌W3来源的CotA漆酶具有良好的酶学性质和工业应用前景。利用BP神经网络偶联萤火虫算法寻优是CotA漆酶发酵培养基优化的有效手段。     

His-tag对亚油酸异构酶在大肠杆菌中可溶性表达的影响

为了研究6×His-tag对来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶(PAI)可溶性重组表达的影响,我们构建了三种大肠杆菌重组菌株,表达了三种重组PAI:C端带有His-tag亲和标签、N端带有His-tag亲和标签和不加His-tag亲和标签。通过SDS-PAGE和Westernblot分析重组蛋白表达情况,并利用气相色谱检测酶活。实验结果表明:在相似的诱导表达条件及生长状态下,三种大肠杆菌重组菌株均成功表达了具有亚油酸异构酶活性的重组蛋白质,三种重组PAI的表达总量相当,6×His-tag的融合表达促进了PAI蛋白质包涵体的形成,而C端6×His-tag带来的影响最大。     

添加剂对漆酶酸碱稳定性的影响及保护机理

为了提高漆酶的稳定性,研究了甘油、肌醇和山梨醇3种添加剂对漆酶酸碱稳定性的影响,并通过紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱分析了添加剂对漆酶的保护机理。研究表明,添加剂对漆酶的保护效果与添加剂的种类和浓度有关。在p H 3的缓冲液中,当肌醇的浓度为0.2 mol/L时漆酶的相对酶活达到最大值(125%),当甘油或山梨醇浓度增加时,漆酶的相对酶活逐渐增大;当添加的浓度相同时,甘油对漆酶的保护效果强于山梨醇,当添加的浓度为0.6 mol/L时,甘油使漆酶相对酶活提高了29%,山梨醇使漆酶相对酶活提高了15%。漆酶适宜的p H值范围为2~5,加入添加剂后提高了漆酶的酸碱稳定性。通过光谱分析可知,通过与漆酶分子间形成氢键,甘油、肌醇和山梨醇可以提高漆酶在溶液中的酸碱稳定性。     

杂合木聚糖酶的设计及在毕赤酵母中的表达

人工设计合成木聚糖酶,为木聚糖酶分子改造研究提供新思路。采用合成生物学思路,以黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2基因序列为基础,将N端48个氨基酸替换成Ev Xyn11 N端的34个氨基酸;引入芳香族氨基酸P9Y和H14F;在C端引入二硫键Cys38-Cys191;α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A,设计杂合酶Xyn ZL。基因全合成后,构建毕赤酵母重组表达质粒p PIC9K-ZL,将其转化酵母菌GS115,对工程菌GS115-XynZL进行单因素发酵条件优化及重组酶酶学性质测定。最佳发酵培养基为土豆培养基,最佳诱导温度为28℃,最佳种龄为20 h,最佳诱导时间为168 h,最佳诱导起始pH值为6. 5,甲醇诱导最佳体积分数为15 mL/L。重组酶酶学性质显示:最佳反应温度为55℃,最适pH值为5. 0,杂合酶Xyn ZL在毕赤酵母中表达后具有特定性质和功能,其设计方法拓宽了木聚糖酶分子改造研究的思路。     

漆酶/组氨酸和漆酶/谷氨酸改善二次纤维性能的比较

本实验通过改变漆酶用量、反应时间、p H、介体用量等,比较经漆酶/组氨酸和漆酶/谷氨酸改性后二次纤维抗张指数和撕裂指数的变化。实验表明:漆酶/组氨酸处理OCC浆的最佳反应条件为:漆酶用量1U/g,反应时间8h,p H值4.5,组氨酸用量1%;漆酶/谷氨酸处理OCC浆的最佳反应条件为:漆酶用量1.5 U/g,反应时间8h,p H值5,谷氨酸用量2%。实验数据显示在最佳反应条件下漆酶/组氨酸比漆酶/谷氨酸处理的抗张指数高出10%,撕裂指数高出9%,并且漆酶/谷氨酸处理的比空白样的抗张指数提高21%,撕裂指数提高18%。从经济效益出发,漆酶/谷氨酸比漆酶/组氨酸更适合用来改善二次纤维的性能。     

助剂对漆酶脱色性能的影响

漆酶是一种多酚氧化酶，研究了漆酶LAC—H对活性艳蓝K-3R和直接大红4BS溶液的脱色性能，确定其最佳应用条件，结果表明，在40℃、pH4.0时，漆酶LAC—H有最佳的综合应用性能；通过添加不同物质（如赫类、醇类、表面活性剂等），研究印染行业常见助剂对其脱色能力的影响．研究了递质低分子质量有机物对漆酶脱色的影响，结果发现：在添加了1-经基苯并三唑后，漆酶的脱色能力获得明显提高．     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。     

南瓜硒多糖的制备表征及活性分析

对南瓜多糖进行硒化修饰,并对南瓜硒多糖的体外抗氧化和抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长等活性进行研究。以提取、分离、纯化的南瓜多糖为前体物,用Na2SeO3硒化修饰制备南瓜硒多糖,并用紫外光谱、红外光谱、原子荧光光谱、热重分析对产物结构进行表征,采用邻苯三酚自氧化法、水杨酸法、四甲基偶氮唑蓝比色法测定其清除超氧阴离子自由基（O2－•）、羟自由基（•OH）的能力以及对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的抑制作用。结果表明：制备产物结构中含有Se＝O键和Se-C键,即实现了南瓜多糖的硒化。南瓜硒多糖对O2 － ·、·OH的清除作用显著强于南瓜多糖,与样品量呈正相关;南瓜硒多糖对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长有抑制作用,比南瓜多糖具有更好的抑制效果。     

高活性谷氨酰胺酶基因glsA2 在枯草芽孢杆菌BJ3-2染色体上的定点整合

以枯草芽孢杆菌BJ3-2 的glsA1 基因为同源序列,通过构建单交换整合载体,将高活性谷氨酰胺酶基因glsA2 定点整合入BJ3-2 菌株染色体中,获得能够稳定遗传的重组菌株BJ3-2A2。经检测重组菌株谷氨酰胺酶活力为BJ3-2 菌株的3.36 倍。利用重组菌株BJ3-2A2 发酵豆豉,全氨基酸检测显示,重组菌株发酵的豆豉谷氨酸含量比出发菌株高12.8%。说明枯草芽孢杆菌BJ3-2 可以转化且为RecE+ 菌株,glsA2 基因在BJ3-2 菌株染色体上可实现较高活性表达,并提高发酵豆豉的鲜味。     

超声波辅助酶预处理对糙米发芽及发芽糙米理化特性的影响

结合超声波和外源酶对糙米进行预处理,利用中心组合试验模型,以超声温度、超声时间、酶质量浓度3 个因素为自变量,糙米预处理后处理液中总糖含量、糙米发芽率、发芽糙米γ-氨基丁酸（γ-amiobutyric acid,GABA）含量为响应值,设计了三因素三水平的响应面分析试验,并对数据进行拟合和相关性分析。同时研究超声波辅助酶预处理对发芽糙米中GABA含量、总酚含量、内源淀粉酶活力以及发芽糙米糊化黏度、蒸煮后质构特性的影响。结果表明：超声辅助酶预处理的超声温度和超声时间对糙米发芽率和GABA含量均有显著的影响。通过响应面分析,超声波辅助酶预处理超声温度31.21 ℃、超声时间0.71 h、酶质量浓度0.28 g/L时,发芽率最高预测值为91.98%;超声波辅助酶预处理超声温度35.65 ℃、超声时间0.5 h、酶质量浓度0.22 g/L时,GABA含量最高预测值为38.25 mg/100 g。从发芽糙米的理化特性来看,超声波辅助酶预处理有利于GABA的富集,但不利于总酚的积累。超声波辅助酶预处理可以有效地提高内源淀粉酶的活力,相应地降低发芽糙米粉的糊化黏度以及发芽糙米蒸煮后的硬度。     

硒对杏鲍菇营养品质和抗氧化酶活性的影响

为了研究硒对杏鲍菇子实体硒含量、营养品质和抗氧化酶活性的影响,通过向培养料中添加Na2SeO3的方式培育富硒杏鲍菇。采用电感耦合等离子体质谱法测定富硒杏鲍菇子实体中的硒含量,分析硒在子实体中的分布情况,并且以普通杏鲍菇为对照,对富硒杏鲍菇的主要营养成分及抗氧化酶活性进行测定。结果表明：杏鲍菇子实体中的硒含量与培养料中硒含量成正相关性,当培养料中硒含量在40～50 mg/kg范围内时,杏鲍菇子实体对硒的生物富集因子最高,达到0.46～0.47,有机化率达到83.00%～84.00%,并且可溶性蛋白质含量和总糖含量与对照组相比分别显著提高了12.02%和25.76%（P＜0.05）,谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著增强（P＜0.05）。杏鲍菇子实体菌盖和菌柄的硒含量并没有显著性差异。本实验研究表明,适宜的施硒量可以提高杏鲍菇子实体中硒含量,有助于改善其营养品质和生理特性。     

生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

大豆过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

新鲜大豆芽经匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的过氧化氢酶。该酶酶活回收率为30.92%,纯化倍数为293.09,酶比活力达到26 322.43 U/mg。该酶全分子质量为234.9 kD,亚基分子质量为57.42 kD;最适pH值为7.2,最适温度为30 ℃,在pH 4.0～10.6及25～35 ℃范围内有较好的稳定性;在30 ℃、pH 7.2条件下测得该酶对过氧化氢的Km值为31.82 mmol/L;十二烷基硫酸钠、草酸、Ag+、Cu2+对该酶有强烈的抑制作用,Pb2+对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用而高浓度时抑制酶活性。     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

重庆地区主要茶树栽培品种生化特性分析

以27 个重庆地区主要茶树栽培品种的1 芽2 叶鲜叶为供试材料,通过测定各品种的主要生化成分,分析各品种在重庆地区与原产地之间的差异性,及比较各品种在重庆的表现特性;并采用相关性、多维尺度和聚类分析探究27 个品种在重庆地区的表现特性及其适制性。结果表明：供试材料在重庆地区表现为氨基酸的变化率最大,咖啡碱和茶多酚含量的变化率次之;表儿茶素没食子酸酯、儿茶素、表没食子儿茶素含量和儿茶素品质指数,以及多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性的变异性较大;茶多酚与氨基酸含量呈负相关性,咖啡碱与茶多酚含量、儿茶素含量和酚氨比呈极显著和显著正相关,PPO和POD活性呈极显著正相关性;通过多维尺度和聚类分析可将供试品种分成4 大类群,且每个类群的茶类适制性都有一定的差异性。     

不同培养基对平菇营养成分、多酚含量及其抗氧化活性的影响

以8种不同组成的培养基培养的平菇为研究对象,测定不同培养基处理对平菇营养成分、多酚含量及其多
酚抗氧化活性（DPPH自由基、ABTS+•清除能力和还原力）的影响。结果表明：灰分、总糖和膳食纤维含量最高的
为培养基H组平菇（H代表平菇培养基编号,下同）,水分、粗蛋白和脂肪含量最高的分别为培养基C、F和B组的
平菇。氨基酸总量平均值最高的是培养基H组平菇。不同培养基处理组平菇之间同种矿物元素含量存在差异,甚至
出现较大差异。检出6 种共有脂肪酸成分,同种脂肪酸在不同平菇中含量不同。不同培养基处理组平菇之间多酚含
量存在差异,培养基E组平菇多酚含量最高;且多酚（游离酚,结合酚）各抗氧化指标随多酚质量浓度的增加而增
加,但不同培养基处理组平菇各抗氧化指标的差异性大小随多酚质量浓度的变化而改变。