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相似文献
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1.
目的制备抗重组人白细胞介素-12(rhIL-12)单克隆抗体(McAb),并建立检测IL-12的双抗体夹心ELISA方法。方法以纯化的rhIL-12(p70)免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测胃癌患者术前、术后血清IL-12水平的变化。结果筛选出3株稳定分泌抗rhIL-12的单抗杂交瘤细胞株,纯化后单抗纯度达95%以上。免疫球蛋白亚类2株为IgG1,1株为IgG2a,轻链属!型,相对亲和力依次为EM5>EM6>EV9。Western blot及ELISA交叉试验表明,单抗具有良好的特异性。建立的双抗体夹心ELISA方法检测rhIL-12的最低检出限为20pg/ml,线性范围为25~3200pg/ml。应用此法检测胃癌患者术前血清IL-12水平较正常对照组明显降低,术后10d明显升高。术后给予免疫增强型NE组IL-12水平较未给予组明显升高。结论制备的抗rhIL-12单克隆抗体,能够用于IL-12的体内外免疫学检测,为IL-12的研究、检测及临床应用奠定了基础。  相似文献   

2.
应用杂交瘤技术获得6株抗人白细胞介素-2单克隆抗体细胞株,并对其特性进行分析,各单抗滴度不一,有的高达10(16),有的则在1∶10左右,大多数(5种)为IgG型,少数(1种)为IgM型。单克隆抗体与纯化的IL-2有明显的特异性吸附(P<0.01)。有4种单克隆抗体有相同的吸附位点,另外2种至少有3个吸附位点,位阻表现不一。  相似文献   

3.
目的表达并纯化重组人白细胞介素-10蛋白,并进行活性检测。方法将重组质粒PCRT7/NT-TOPO-IL-10转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞,IPTG诱导表达。采用Ni柱对表达产物进行亲和纯化,并检测其对外周血单核细胞分泌TNF-α的影响。结果IPTG诱导4h,目的蛋白表达量最高,可达45.02%,主要以包涵体形式表达。纯化后,所得目的产物的回收率为66.72%,纯度约为80.42%。纯化的IL-10对外周血单核细胞分泌TNF-α具有抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组IL-10蛋白。  相似文献   

4.
阿那白滞素(Anakinra)是一类重要的白细胞介素-1β的抑制剂,对于治疗多种疾病引起的并发症具有重要作用。采用分子对接和分子动力学方法研究了Anakinra抑制白细胞介素-1β的分子作用机制。结果表明,Anakinra可由氢键作用结合于白细胞介素-1β的表面,它的结合使白细胞介素-1β的结构趋于稳定,从而抑制其生物活性。Anakinra的结合没有明显改变白细胞介素-1β的亲水性和疏水性,白细胞介素-1β内部氢键数目的改变是稳定性发生改变的主要原因。  相似文献   

5.
目的建立重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的质控方法和标准。方法采用黑色素瘤A375.S2细胞杀伤中和试验测定rhIL-1ra的生物学活性,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的质控方法对rhIL-1ra原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论建立的质控方法和标准可保证产品安全有效,可用于rhIL-1ra的检定。  相似文献   

6.
目的建立重组人溶菌酶(human lysozyme,h LYZ)的分离纯化方法,并对纯化产物进行鉴定。方法采用固液分离、膜过滤、疏水层析及离子交换层析对hLYZ进行分离纯化;SDS-PAGE及HPLC法检测hLYZ纯度;按《中国药典》二部(2015版)蛋清溶菌酶效价检查法检测其效价;Western blot法检测其特异性;基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其相对分子质量。结果该分离方法可获得单一组分的重组hLYZ;SDS-PAGE检测纯度达99%,HPLC分析纯度达98. 8%;纯化后的hLYZ可与抗人LYZ抗体特异性结合,活性为1. 2×105 U/mg,相对分子质量为14 697。结论建立的分离纯化方法易操作,成本低,得到的hLYZ纯度大于98%,该分离方法可用于hLYZ的规模化生产。  相似文献   

7.
目的建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性。方法取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液,采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量,并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Westernblot对纯化样品进行鉴定;以PBMCIFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性。结果纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测,其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40000和35000)相符;Westernblot分析显示,rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×106IU/mg。结论已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化工艺,该工艺成本低,操作简便,纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产。  相似文献   

8.
目的对人白细胞介素-24(hIL-24)进行克隆、表达和纯化。方法分离人外周血单个核细胞,ConA刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致。所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21(DE3)后,37℃诱导表达相对分子质量约为44000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%。经纯化后,纯度达85%以上。Westernblot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应。结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础。  相似文献   

9.
北京四环生物制药有限公司研制的重组人白细胞介素-2注射液获得国家新药证书,同时公司研制的规格为50万IU/瓶、100万IU/瓶的重组人白细胞介素-2注射液获得生产批文。重组人白细胞介素-2注射液是该类产品的新剂型,为国内独家首创,也是国际上目前惟一水针剂型产品.市场前景极为广阔。  相似文献   

10.
目的优化重组人白细胞介素-31(rhIL-31)的表达条件。方法以不同浓度IPTG、不同诱导时间、不同诱导温度对含有pET32a/rhIL-31的工程菌E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果诱导时间为5h,IPTG浓度为1.5mmol/L,诱导温度为37℃时,rhIL-31的表达量最高。结论已初步优化了重组蛋白rhIL-31的表达条件。  相似文献   

11.
基因工程人白细胞介素-2(rIL-2)样品首先经垂直SDS-PAGE按其分子量大小分开,再经电转移仪转到硝化纤维膜上,用小牛血清或牛血清白蛋白封闭空余位点后,加入鼠抗人卫IL-2单克隆抗体(DMS-1),室温作用1.5小时后洗膜,加入兔抗BALB/c鼠IgG-HRP,作用后加入二氨基联苯胺显色,以显色带的位置和带数来判断制品的特异性和纯度。我们的产品经显色后只见一条带,分子量为1.5万,未见多聚体,达到免疫纯。  相似文献   

12.
重组人白细胞介素-6包含体溶解工艺研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L和 5 0mol/L ,包含体含量为 1 0mg/mL ,在 4℃下溶解 1h。包含体溶解后蛋白含量可达到 1 3mg/mL左右 ,目标蛋白的溶解率达到 98% ,纯度为 5 0 %左右  相似文献   

13.
目的构建携带人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1Ra)基因重组腺病毒质粒。方法用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切质粒pcDNA3-hIL-1Ra,获得hIL-1RacDNA片段,并定向连接在pShuttle-CMV穿梭载体上,构建穿梭质粒pShuttle-CMV/hIL-IRa。经PmeⅠ酶切线性化,穿梭质粒pShuttle-CMV/hIL-1Ra与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,二质粒在细菌内同源重组,得到重组pAd/hIL-1Ra腺病毒质粒。脂质体介导pAd/hIL-1Ra质粒转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒,经反复感染HEK293细胞扩增病毒后,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,并测定病毒颗粒数、纯度及滴度。结果经PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组pShuttle-CMV/hIL-1Ra穿梭质粒和重组pAd/hIL-1Ra腺病毒质粒。扩增纯化后,重组腺病毒颗粒数为1.19×1011OPU/ml,A260/A280为1.279,滴度为3.6×109CCID50/ml。结论已成功构建重组腺病毒质粒pAd/hIL-1Ra,为hIL-1Ra基因在腺病毒载体介导下的免疫抑制治疗研究奠定实验基础。  相似文献   

14.
白细胞介素 1 1 (IL - 1 1 )是一种具有调节功能的蛋白质。一般采用含有IL - 1 1基因的硫氧还蛋白系统在重组大肠杆菌中来表达制备IL - 1 1融合蛋白 ,产物经金属鏊合层析进行初次分离。本文对融合蛋白IL - 1 1进行亲合纯化工艺研究 ,结果表明 ,IL - 1 1的纯度和回收率均达到较高的水平 ,为后续的纯化奠定了基础  相似文献   

15.
重组人表皮生长因子的分离和纯化工艺的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
探讨了人表皮生长因子的分离思路并据此研究了人表皮生长因子的分离工艺,特别是对工程发酵液理化特征和各层析单元操作的结果进行了详细地研究分析.结果表明发酵液中目标产物与杂蛋白质间的分子量相差较大,其等电点也有一定的差距.在层析分离单元中,凝胶层析可使人表皮生长因子的纯度提高至94%以上,收率达72%以上;而离子交换层析与扩张床吸附则具有较高生产力的特点.根据不同的层析操作所提出的三条生产工艺而生产的人表皮生长因子可满足不同的市场需求.  相似文献   

16.
目的纯化和复性rhIL18,并测定其生物学活性。方法采用提取包涵体、分子筛层析及离子交换层析的方法纯化rhIL18,经稀释法复性,用IL18诱导PBMC产生IFNγ,ELISA法检测上清中IFNγ的水平。结果rhIL18纯度大于95%,复性回收率达30%以上,获得的产品可诱导PBMC产生大量的IFNγ,且呈剂量依赖关系。结论该纯化、复性方法为大量生产rhIL18打下了基础。  相似文献   

17.
目的纯化重组人干扰素β1a(recombinant human interferonβ1a,rhIFNβ1a),并分析其理化性质。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体培养表达rhIFNβ1a的重组CHO细胞,细胞培养收获液经超滤浓缩、蓝胶亲和层析、脱盐和CM离子交换层析纯化后,采用水泡性口炎病毒抑制法测定rhIFNβ1a的效价;Lowry法测定蛋白含量;等电聚焦电泳法测定其等电点;SDS-PAGE和高效液相色谱法测定其纯度;Western blot法分析其免疫活性;SDS-PAGE和质谱仪测定其相对分子质量;圆二色谱法分析其二级结构。结果共纯化了3批样品,纯化的rhIFNβ1a平均蛋白浓度为0.284 0 mg/ml,平均比活可达1.06×108IU/mg,纯度达95%以上,蛋白质平均回收率为58.36%,蛋白质相对分子质量为20 445.0,等电点约为6.6,免疫活性良好,二级结构与国家标准品基本一致。结论成功纯化了rhIFNβ1a,并检测了其理化性质,为建立大规模制备rhIFNβ1a的生产工艺和制造检定规程,实现产业化奠定了基础。  相似文献   

18.
人白细胞介素-29的生物信息学分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的利用生物信息学技术对人白细胞介素-29(Human nterleukin-29,IL-29)进行分析,为定点突变hIL-29,以提高其生物学活性奠定理论基础。方法利用生物信息学技术分析克隆得到的hIL-29基因,预测hIL-29基因编码蛋白的理化性质、结构、功能及可能影响其生物学活性的关键氨基酸位点;预测其三维结构,并与IFNλ3的晶体结构进行比对;对检索到的9个物种的IL-29基因同源序列进行比对,并构建系统进化树。结果 hIL-29基因编码蛋白含200个氨基酸残基,其N-末端19个氨基酸为信号肽,成熟肽的相对分子质量为20 018,理论等电点为9.08,肽链中含一个由胞内向胞外的跨膜结构域;hIL-29的空间构象由6个α螺旋(A~F)和无规则卷曲组成,螺旋A、B和F可能是hIL-29与特异性受体结合而发挥生物学效应的活性部位,A、F螺旋中有4个氨基酸残基可能是影响其生物学活性的关键氨基酸位点;系统进化分析显示,hIL-29与狗、猫、大熊猫、马、野猪、黑猩猩、长臂猿的IL-29具有较高的同源性,处于同一个大分枝,而人、黑猩猩、长臂猿的IL-29处于同一个小分枝,在系统进化树中的距离最近。结论关键位点氨基酸的差异可能对hIL-29的生物学活性影响较大,可作为对hIL-29进行分子改造的突变位点。本研究为后续进行hIL-29的定向改构及其构效关系等的深入研究奠定了理论基础。  相似文献   

19.
目的 从杂交瘤细胞的培养上肖中纯化低浓度单克隆抗体。方法 采用离子交换层析与凝胶过滤相结合进行分离纯化。结果 纯化IgG抗体纯度>90%,总回收率为34%。结论 除了杂蛋白的等电点与目的蛋白相近的情况外,这种方法可应用于低浓度蛋白的分离纯化。  相似文献   

20.
目的 将表达重组人白细胞介素11(rhIL-11)的毕赤酵母,分别进行常规的补料分批培养和连续培养,以获得一种高蛋白产率及低蛋白降解的培养方式。方法 两种培养方式均在10L的发酵罐中进行,常规的补料分批培养方式历时3~4d,连续培养方式则是在前者的基础上,以D=0.05/h的稀释率进入连续培养阶段,整个过程历时约20d。发酵过程取样测菌体A_(600)及SDS-PAGE分析。结果 连续培养方式rhIL-11蛋白的产出率约为常规补料分批培养方式的1.5倍。在发酵过程中,常规补料分批培养方式在第2天就出现了降解,而连续培养方式则在第17天才出现。结论 连续培养方式对rhIL-11生产具有较大的使用前景。  相似文献   

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