适于β-内酰胺类抗生素耐药机制检测用参考菌株的研制

目的:为了满足系列食品中食源性致病菌携带的β-内酰胺类抗生素耐药机制快速检测需求,开展了携带此类抗生素耐药性编码基因沙门氏菌参考菌株定性标准样品的研制,以提供溯源性强、评价准确度高、易在各检测机构间开展耐药微生物检测的技术保障。方法:活化实验室-80℃保存的3株沙门氏菌,通过PCR、DNA测序和BLAST比对验证其所携带的β-内酰胺类抗生素耐药机制编码基因,同时检验目标基因的遗传稳定性。在真空冷冻干燥条件下制备活菌量为106～107CFU/瓶的菌株标准样品。按照GB/T 15000.3-2008要求对参考菌株标准样品进行均匀性检验,使用方差分析法(F检验)对结果进行统计分析、均匀性评价。分别于37,4℃和-80℃模拟运输和贮藏条件,检验参考菌株的稳定性。委托具有检验资质的7家实验室对参考菌株进行联合定值。结果:3株候选参考菌株中1株同时携带β-内酰胺类抗生素耐药机制编码基因blaCTX-M-55/blaTEM-1,1株同时携带blaTEM-1/blaOXA-1/blaCTX-M-l5,1株携带blaCTX-M-3,在15代内均可稳定遗传。制备的参考菌株均匀性良好。在37℃贮藏13 d,...     

食品能力验证中沙门氏菌的分离和鉴定

目的为了提升实验室食品中沙门氏菌检测能力,增强实验室竞争能力,本实验室参加了中国食品药品检定研究院组织的沙门氏菌检测能力验证活动。方法依据中华人民共和国国家标准GB 4789.4-2010,采用传统分离方法和血清学鉴定,联合全自动微生物生化鉴定系统(VITEK2-compact)对分离出的疑似菌进行生化鉴定。结果编号为CODE1样品+CODE1奶粉混合样检出纽波特沙门氏菌和科林德尔沙门氏菌,CODE3样品+CODE3奶粉混合样检出维普拉沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和埃科沙门氏菌,其余8个样品未检出。结论顺利完成本次能力验证活动。     

食品能力验证中沙门氏菌的分离鉴定与血清分型

目的参加沙门氏菌分离鉴定与血清分型的能力验证,以加强实验室整体水平与能力。方法参照GB4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学沙门氏菌检验》进行沙门氏菌检测,将生化试验与VITEK2鉴定结果符合沙门氏菌编号的样品进行血清学试验。结果编号CODE 1样品检出巴尔多沙门氏菌,CODE 3样品检出鼠伤寒沙门氏菌,其余8个样品均未检出沙门氏菌。本实验室顺利完成能力验证实验,与组织方结果一致,结果为满意。结论参加能力验证是提高检验机构内部质量控制最有效的手段之一,可有效提高检验机构出具检验数据的可靠性和有效性,确保实验室持续维持较高的检验水平。     

食源性致病菌药敏性检测用参考菌株的研制

目的 鉴于当前食源性致病菌药敏性测定用质控菌对常用抗生素较敏感,而我国分离的大部分菌株对常用抗生素较耐受,药敏性测定时需选择的抗生素浓度范围非常大,导致抗生素浪费,测试结果不准确。方法 本研究研制了5种抗生素最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)赋值明确、可用于食源性致病菌(乌普萨拉沙门氏菌、苏卜拉沙门氏菌、汤普森沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌)对常见抗生素(链霉素、庆大霉素、氯霉素、头孢西丁、氨苄西林等)药敏性检测用的菌株标准样品。采用琼脂稀释法和微量肉汤稀释法测定菌株的药敏性,使用真空冷冻干燥方法制备参考菌株标准样品。结果 分别研制得到链霉素、庆大霉素、氯霉素、头孢西丁、氨苄西林MICs赋值明确的参考菌株,菌株药敏性遗传稳定、均匀性和贮存稳定性良好。分别在37 ℃、4 ℃和-80 ℃条件下贮存13、90、360 d后,活菌量基本维持在10⁵ CFU/瓶以上,确定的耐药表型均可检出,抗生素MICs值未出现较大波动或漂移。结论 符合我国食源性致病菌耐药特性、抗生素MICs赋值明确菌株标准样品的研制,将有助于丰富我国参考菌株种类,可以进一步加强耐药菌监测,确保食品安全。     

肠炎沙门氏菌和哈瓦那沙门氏菌的耐药性及耐药基因分析

为了保障食品安全,更好的了解耐药性的产生及传播的途径,研究了新疆乌鲁木齐市部分农贸市场内检出的17株肠炎沙门氏菌和11株哈瓦那沙门氏菌的药敏性及相关耐药基因。用琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性,用聚合酶链式反应和测定基因序列的方法确定耐药沙门氏菌中与喹诺酮类药物相关的抗性决定区突变基因以及质粒携带的耐药基因。17株肠炎沙门氏菌对环丙沙星和头孢西丁表现为100%敏感,对萘定酮酸的耐药率为94.1%,头孢曲松的耐药率为17.6%,qnr B检出率为64.7%,17株肠炎沙门氏菌发生Gyr A基因突变,主要突变类型为Asp87Tyr;11株哈瓦那沙门氏菌对甲氧芐啶、氯霉素、磺胺二甲异唑、磺胺甲基异恶唑/甲氧苄啶、萘啶酮酸、头孢西丁的耐药率为100%、63.6%、36.4%、18.2%、9.1%和9.1%,氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸敏感率为100%,qnr B,qnr S的检出率均为9.1%,11株哈瓦那沙门氏菌Par C基因突变类型为Thr57ser。新疆乌鲁木齐肠炎沙门氏菌和哈瓦那沙门氏菌耐药情况比较严重,对抗生素的耐药状况应当予以关注,其喹诺酮类药物耐药决定区突变基因及质粒携带的耐药基因在一定程度上会影响肠炎沙门氏菌和哈瓦那沙门氏菌的耐药机制。     

食源性沙门氏菌鉴定和血清分型能力验证

目的验证本实验室在国家食品安全风险监项目中微生物检验能力和实验室质量控制水平。方法实验样品按照考核方作业指导书要求进行样品前处理后,参照GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学沙门氏菌检验》进行沙门氏菌检验,同时取增菌液与预增菌液使用全自动病原微生物检测系统进行鉴定。将全自动病原微生物检测系统鉴定结果与生化试验相结合进行对比,结果均符合沙门氏菌属的样品再进行血清学鉴定。结果编号2017S-16(3)-1样品检出鼠伤寒沙门氏菌,2017S-16(3)-2样品检出阿贡纳沙门氏菌,2017S-16(3)-3样品未检出沙门氏菌。本实验室顺利完成考核,结果与考核方一致。结论本实验室通过参加能力验证和质控考核,提升食品检验机构检验能力和实验室质控水平。     

沙门氏菌耐药谱及质粒耐药基因的筛查

目的:分析不同来源沙门氏菌耐药性及其质粒耐药基因携带情况,从而揭示质粒耐药基因与菌株耐药性的对应关系。方法:对226株食源性及医源性的沙门氏菌分离株用试卡法测试其耐药性,按2012年美国实验室标准委员会(CLSI)指导原则的标准计算细菌对抗菌药物的耐药率(R),中介率(I),和敏感率(S),并对具有耐药表型和中介表型的非敏感菌株进行质粒耐药基因的筛查。结果:针对青霉素类抗生素进行筛查,耐氨苄青霉素的菌株达到15.9%(36/226),耐舒巴坦/氨苄青霉素达到12.8%(29/226);针对氨基糖苷类抗生素,耐妥布霉素的菌株达到6.2%(14/226),耐庆大霉素5.8%(13/226);针对喹诺酮类抗生素,耐环丙沙星的菌株达到4.0%(9/226),耐左氧氟沙星1.8%(4/226);针对头孢菌素类抗生素,耐头孢唑啉4.4%(10/226),耐头孢他啶和头孢曲松分别为2.2%(5/226),耐头孢替坦0.9%(2/226)。针对碳青霉烯类和除青霉素类、头孢菌素类以外的β-内酰胺类的筛查结果均为敏感。β-内酰胺类抗生素非敏感菌株中,质粒上β-内酰胺类耐药基因携带率为59.5%(50/84),其中CMY基因携带率为10.7%(9/84),OXA基因携带率为27.3%(23/84),TEM基因携带率为39.2%(33/84),PSE基因携带率为1.2%(1/84)。喹诺酮类抗生素非敏感菌株中,质粒上喹诺酮类耐药基因携带率为14.7%(5/34),其中qnrA基因携带率为11.8%(4/34);qnrS基因携带率为2.9%(1/34)。对喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素非敏感菌株中,质粒上acc(6’)-Ib-cr基因的携带率为17.1%(7/41)。仅CMY基因在食源性和医源性分离株中的分布具有统计学差异(χ2=5.480,P0.05)。结论:本研究涉及的沙门氏菌分离株中,对青霉素类抗生素耐药性较强,其次是氨基糖苷类、头孢菌素类和喹诺酮类。大多数耐β-内酰胺类抗生素的沙门氏菌菌株都携带相对应的质粒耐药基因,而耐喹诺酮类以及氨基糖苷类抗生素的沙门氏菌携带相对应的质粒耐药基因较少。     

食源性沙门氏菌耐药表型与耐药基因的研究

为了解食源性沙门氏菌（Salmonella）的耐药状况以及耐药基因与耐药表型的关系,从基因水平上探究Salmonella的耐药机制。本研究对215 株分离自1 093 份市售新鲜肉类中的Salmonella进行了耐药状况检测,设计了16 种引物对耐药基因进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增,并对扩增产物进行克隆测序。结果显示,分离株对磺胺异恶唑耐药率最高（71.7%）,其次为四环素（69.8%）、甲氧嘧啶（67.9%）和复方新诺明（52.8%）,分离株对环丙沙星、呋喃妥因和头孢类比较敏感。三重及以上耐药的菌株占60.5%,最多可以耐受13 种抗生素;PCR共扩增到10 种耐药基因,测序结果表明扩增到的序列与GenBank上相应参考序列的相似性均在99%以上;β-酰胺类以及四环素类的耐药基因检出情况与耐药表型具有很高的一致性,符合率均在90%以上,其次为磺胺类（81.6%）。说明本研究中的食源性Salmonella分离株的耐药率高,多重耐药情况较为严重,耐药表型与耐药基因检测结果基本一致。     

调味粉中沙门氏菌的分离与鉴定

从某调味粉食品内分离到1株可疑沙门氏菌属,经分离培养、初步筛选、革兰氏染色形态学观察、生化试验及血清凝集试验鉴定为沙门氏菌,并对其进行分型确定为鼠伤寒沙门氏菌,其抗原模式为1,4,5,12∶i∶1,2.     

餐厨垃圾原位处理菌株的筛选和鉴定

按照产酶能力强、菌株间无拮抗性的原则,从本实验室27株菌中筛选到2株淀粉酶产生菌;苏云金芽孢杆（Bacillus thuringiensis、TKFW r8）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis、TKFW 10004）,2株蛋白酶产生菌;蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereu. frankland 、TWKF 11014）和纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto、TWKF 11002）。将该4株菌与植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum、TWKF 12006)和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen、TKFW 13024）等比例组合,试验结果表明处理后的餐厨垃圾没有恶味,蚊虫较少,具有淡淡的酒香味,能够抑制病原微生物的生长,具有一定的减量效果。为了保证菌株的生物安全性,对未知菌TKFW r8进行观察和鉴定,通过16S rDNA序列分析,确定为苏云金芽孢杆菌。     

产酸克雷伯式菌(Klebsiella Oxytoca XCH-1)的分离鉴定及其特性研究

从青岛海藻化工厂海带浸泡液中分离筛选出1株菌,该菌在生长过程中产生大量的粘性胞外多糖。对该菌的形态特征、生长和生理生化特性进行了研究,经鉴定该菌为产酸克雷伯式菌(Klebsiellaoxytoca),命名为KlebsiellaoxytocaXCH-1。     

Reference samples for checking the performance of Salmonella isolation methods

In this paper a review is presented of the development, evaluation and application of reference samples for checking the performance of Salmonella isolation methods. It is concluded that reference samples consisting of 0.2 g of spray-dried milk, artificially contaminated with Salmonella typhimurium and contained in gelatin capsules, are suitable for that purpose and should be introduced in laboratory quality assurance programmes.     

一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及鉴定

从24株不同来源的酵母菌中分离筛选出一株对2-苯乙醇耐受性强、生物转化合成2-苯乙醇能力高的优良菌株SH003,该菌株能在含有4 g/L的2-苯乙醇培养基中生长,在优化的转化条件下,转化合成2-苯乙醇质量浓度达4.31 g/L,生成速率为0.18 g/(L·h),L-苯丙氨酸摩尔转化率为72.4%,经菌落特征、菌体形态分析、生理生化试验,结合18S r DNA序列分析,由系统发育树表明它与酿酒酵母亲缘关系最近,确定该菌株为Saccharomyces cerevisiae。     

高产柚苷酶菌株的筛选及鉴定

以柚苷为诱导底物,通过稀释平板法和透明圈法,从柑橘林下土壤和腐烂柑橘皮中筛选出1株柚苷酶生产菌株。该菌株摇瓶发酵酶活力达264.07 U/m L。通过微生物形态学鉴定以及基于r DNA-ITS序列的系统发育分析,鉴定菌株为棘孢曲霉。该菌株具有较强的降解柚苷能力以及较好的选育潜力。     

3种微量化试剂对沙门氏菌及近源菌的生化鉴定结果比较

评价本实验室研制的沙门氏菌微量生化鉴定试剂盒（简称EasyID）的使用性能。用49株菌（包括沙门氏菌12株标准株,16株分离株;志贺氏菌8株标准株;柠檬酸杆菌1株标准菌和8株分离株;变形杆菌1株标准株和2株分离株;产气肠杆菌1株标准株）,测试EasyID,传统液态生化管（简称HKM）以及国内其他品牌（简称GSA和GSB）的四种鉴定试剂盒。结果表明：49株测试菌株的鉴定结果,EasyID、GSA和GSB三种试剂与HKM传统液态鉴定试剂盒鉴定结果相比总体符合率分别为100%、94.46%、95.10%,EasyID相比GSA和GSB,与HKM的符合率更高;EasyID、HKM、GSA和GSB四种鉴定试剂盒与伯杰氏手册相比总体符合率分别为97.96%、97.96%、93.00%、94.70%,EasyID和HKM符合率最高,其次为GSB,GSA稍低。结论：EasyID沙门氏菌微量生化鉴定试剂盒在可靠性上与传统生化管完全一致,在使用方便性上,采用一步加样技术的EasyID优于HKM、GSA和GSB。     

肠炎沙门氏菌活菌标准物质的研制

本文以肠炎沙门氏菌为选制菌种,用鸡肉糜混合保护剂配方作为活菌标准物质基质,采用冷冻真空干燥法研制活菌标准物质,共进行了3个批次的研究,每个批次分别制备100份熟制基质和100份生制基质的活菌标准物质。均匀性试验结果表明,生制基质和熟制基质的相对重复性标准差为2.185%和3.596%、相对再现性标准差为2.185%和3.514%,方差分析:P值均大于0.05,表明批次内以及批次间无显著差异。稳定性试验表明,在-20℃条件下,2种活菌标准物质稳定性良好。制备的肠炎沙门氏菌活菌标准物质具有相应的菌种特性,良好的稳定性,对研究同类型标准物质具有一定的参考价值,填补实验室检测质量控制对照物以及标准物质的空缺。     

一株鸭梨酒酵母菌的鉴定

从市售鸭梨果皮中分离出1株酵母菌，经形态与培养特征、酵母假菌丝的观察、酵母菌子囊孢子的观察和生理生化试验，初步鉴定将酵母菌株GY定为酵母属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisive)。(孙悟)     

四重荧光定量PCR法鉴定肠炎、鼠伤寒以及伤寒沙门氏菌

目的建立四重荧光定量PCR体系鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。方法针对沙门氏菌属特异性ompC基因、肠炎沙门氏菌sdf基因、鼠伤寒沙门氏菌STM4495和伤寒沙门氏菌STY2021序列设计引物和TaqMan探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究。结果 28株不同血清型的沙门氏菌均扩增出ompC基因,其他13株非沙门氏菌均未出现ompC的非特异性扩增。sdf、STM4495、STY2021的探针和引物分别特异性扩增出肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌,而25株其他血清型沙门氏菌以及13株非沙门氏菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系的最低检测限分别为48 pg/mL(ompC)、560 pg/mL(sdf)、530 pg/mL(STM4495)、35 pg/mL(STY2021)。结论该方法特异好、灵敏高、能够快速检测沙门氏菌并鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。     

产谷氨酰胺转胺酶菌种的筛选鉴定

主要介绍了转谷氨酰胺酶产生菌的筛选以及菌种的鉴定。利用凝胶法进行初筛得到产转谷氨酰胺酶的菌株,再通过Folk的比色法确定菌株产转谷氨酰胺酶的量,得到SW-14(0.38 U/mL)和SW-215(0.42 U/mL)两株菌。根据在不同培养基上的培养特征以及生理生化特征对两产酶菌株的进行菌种鉴定。初步鉴定得到的两个菌株属于放线菌科的链霉菌属(Streptomyces sp.)。