全细胞SELEX法筛选单增李斯特菌的ssDNA适配体

以单增李斯特菌活细胞为靶标,采用指数富集配基的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从含40个随机碱基序列的单链DNA(single-stranded DNA,ss DNA)文库中筛选与之特异性结合的适配体。酶联配体吸附法(ELASA)测定筛选过程中次级文库与单增李斯特菌结合力的变化。对筛选得到的适配体进行序列测定,RNA structure软件预测二级结构,ELASA测定适配体与靶标的结合能力和特异性。结果显示,每轮筛选后次级文库与靶标的亲和力增强,特异性适配体逐步得到富集。测序获得23条适配体,其序列同源性不高,但预测的二级结构有些相似,根据二级结构将其分为3个群,分析结果表明二级结构与适配体的亲和力有关。挑选亲和力较强的21号(Lma-21)和35号(Lma-35)适配体能特异性地识别单增李斯特菌。本研究为开发食源性病原菌单增李斯特菌的新型检测试剂提供了基础材料。     

免疫磁珠检测食品中单增李斯特菌的研究

免疫磁珠技术因其具有操作简便、高效快速等特点,目前已被广泛地应用于食品的快速分离纯化和检测领域中。本研究建立了单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的免疫磁珠(Immune magnetic beads)检测方法,实现对单增李斯特菌的快速检测。通过对单增李斯特菌免疫磁珠添加量、免疫磁珠与菌液最佳反应时间、免疫磁珠分离单增李斯特菌的敏感性试验、特异性试验的研究,确定了单增李斯特菌抗体添加量50μg/mL、免疫磁珠添加量100μL,免疫磁珠与菌液最佳作用时间为30min。结果表明免疫磁珠法可快速特异地检测出食品中单增李斯特菌,检测灵敏度底限为10-7,相应的细菌浓度为14cfu/mL。该方法反应灵敏度高,特异性强,大大节省了检测时间和费用,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测。因此研究食品中单增李斯特菌快速、准确检测方法以预防和控制食品安全事件的发生,具有重要的现实意义。     

肽核酸荧光原位杂交技术快速检测食品中的李斯特菌属及单增李斯特菌

目的建立利用肽核酸荧光原位杂交技术(PNA-FISH)快速检测食品中李斯特菌属及单增李斯特菌的方法。方法针对李斯特菌属、单增李斯特菌分别设计合成2份PNA探针lis-16S-1、lm-16S-2,并建立荧光原位杂交技术,优化杂交条件,对选取的13株李斯特菌和其他9株非李斯特菌进行检测,验证探针的特异性和灵敏度,并对118份食品样品用LB肉汤2次增菌培养后进行PNA-FISH检测。结果探针灵敏度和特异性均为100%,从118份食品中检出14株李斯特菌和8株单增李斯特菌,结果与API方法和VITEK方法鉴定结果一致。结论 PNA-FISH方法可靠易行,对从食品中检测致病性单增李斯特菌有较高的实用性。     

实时RT-PCR检测存活于乳中的单核细胞增多性李斯特菌

单增李斯特菌是一种可在低温下生长、能引起人畜共患病的食源性致病菌.为克服传统PCR检测的假阳性问题,有效的检测单增李斯特活菌,本研究提取单增李斯特菌的总RNA并进行反转录,以单增李斯特菌的必要毒力基因hlyA为靶基因,设计特异性引物和TaqMan探针进行实时PCR检测,研究了检测的特异性和灵敏度,考查了对人工污染牛乳进行检测的应用性.结果表明,所用引物和探针能较好的扩增目的基因,而对其他食源性致病菌无交叉反应.单增李斯特菌经1h增菌,可检出3×102CFU/ml.而经3h增菌,活菌检测限可达30CFU/ml.人工污染牛乳样品经6h增菌,检测限为17CFU/ml.此方法可应用于乳中单增李斯特菌的快速检测和污染状况调查.     

单核细胞增生李斯特氏菌LAMP试剂盒的研制及在食品检测中的应用

利用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立食品中单增李斯特氏菌的检测方法。通过对反应条件的优化,组装单增李斯特氏菌LAMP检测试剂盒,并对其特异性、敏感性和适用性进行验证。试验结果显示:该试剂盒适用于食品中单增李斯特氏菌的快速检测,用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达17CFU/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测120种样品中的单增李斯特氏菌,两种方法的符合率达100%。该试剂盒具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。     

荧光免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测单增李斯特菌

为建立单增李斯特菌简单快速、灵敏度高和特异性强的检测方法,本研究以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠;以羧基荧光微球标记的抗单增李斯特菌多克隆抗体及鼠IgG为标记抗体,抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠二抗分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离与荧光免疫层析法相结合应用于单增李斯特菌的现场快速检测中。结果表明:荧光免疫层析试纸条对纯培养单增李斯特菌的检测限为4×105CFU/mL,联合检测方法10倍、100倍浓缩时,检测限分别为4×104CFU/mL和1×104CFU/mL。联合检测体系特异性较好,与实验室保存的10株细菌无交叉反应。人工污染样本检测限为1×104CFU/mL,同纯培养物相比检测灵敏度并没有降低。本方法的建立对于食品中单增李斯特菌的现场快速检测具有重要意义。     

单核增生李斯特氏菌近红外快检方法建立与应用

目的建立一种近红外荧光免疫法快速检测单增李斯特氏菌的方法。方法采用近红外荧光染料Dylight800标记单增李斯特菌单克隆抗体,结合免疫侧向流技术制备单增李斯特菌快速检测试纸条。结果整个实验过程仅需45 min,对食品中单增李斯特氏菌最低检测限为500 CFU/mL,与其他5种食源性致病菌均无交叉反应。特异性为89.47%,敏感性为100%。采用近红外荧光免疫层析法和传统方法对30份食品进行检测,结果发现2种方法符合性达93.3%。结论所研制的单增李斯特菌的近红外快检试纸条具有特异性、敏感性较高的特点,适用于食品样本中单增李斯特菌的即时检测。     

实时荧光PCR定量检测食品中单增李斯特菌

目的建立快速、敏感、特异的食品中单增李斯特菌检测方法。方法针对单增李斯特菌溶素A基因（hlyA）设计一对引物和一条探针，并用该引物和探针运用实时荧光PCR技术对单增李斯特菌的DNA、细胞、质粒和样品进行实时荧光PCR定量检测。结果利用实时荧光PCR技术，建立了DNA校正曲线、细胞校正曲线和质粒校正曲线。DNA校正曲线在1～32CFU/ml、细胞校正曲线在32—320CFU／ml、质粒校正曲线在1—37Copies／ml，线形关系良好，且三种校正曲线检测样品得出的结果基本吻合。结论本试验建立起来的实时荧光PCR定量检测单增李斯特菌的方法灵敏度高、特异性好、准确，可应用于食品中单增李斯特菌的检测。     

环介导等温扩增技术快速检测食品中的单增李斯特氏菌

采用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测食品中的单增李斯特氏菌,并做特异性、敏感性和适用性试验。试验结果显示以单增李斯特氏菌hly基因保守区设计特异性引物,进行DNA等温扩增是可行的。3株单增李斯特氏菌均扩增出特异性目的片段,而10株非单增李斯特氏菌均未产生目的片段。用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达100cfu/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测50种样品中的单增李斯特氏菌,结果数据显示两种方法的符合率达100%,表明环介导等温扩增法具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。     

单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.     

3种常见食源性致病菌多重重组酶聚合酶扩增检测方法研究

目的建立了食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌多重重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）快速检测方法。方法选择沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因和蜡样芽孢杆菌16S RNA序列为目标基因进行扩增,建立并优化多重RPA扩增体系和扩增条件;评价反应体系的特异性和灵敏度,并对人工污染食品样品和实际样品进行检测。结果多重RPA反应体系能够在20 min完成三种目标基因的扩增,特异性强;对沙门菌、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的灵敏度分别为2.70×105、1.30×105、1.44×104 CFU/mL;能够用于人工污染样品和实际样品的检测。结论本研究建立的多重RPA等温扩增方法特异性强,操作快速、简单,为食源性致病菌的快速检测提供新方向     

肉中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法建立

目的:建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法:采用聚合酶链式反应技术(PCR)特异性扩增单核细胞增生李斯特菌内化素基因(ivlA),并评价该方法的特异性与敏感性。结果:在445bp处出现inlA基因的目的片断,只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性;该方法可以检测到DNA的检测限。结论:PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便;为肉中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

环介导等温扩增技术快速检测奶粉中的单增李斯特菌

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下特异、灵敏、快速的新型基因扩增技术。试验以单增李斯特菌为研究对象,根据其特有的hlyA基因设计了一套特异性引物,进行LAMP扩增。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的灵敏度为2.45×101cfu/mL,其对人工感染奶粉样品的检出限为7.32×101cfu/mL。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带,特异性强。表明LAMP法适合于食品中污染单增李斯特菌的快速检测。     

食品中3种致病李氏菌MPCR-DHPLC检测方法的建立

应用复合PCR(multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的快速高通量检测方法。根据单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的特异基因序列分别设计引物,MPCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以94株参考菌株做特异性实验,并开展了重现性检测实验。MPCR-DHPLC方法同步检测到单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的特异性阳性吸收峰,未检测到李斯特菌属其他近源种和非近源种参考菌株的阳性吸收峰,且重现性良好。该方法具有很好的特异性,可以快速、准确、高通量地检测食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌,是食品微生物快速检测的新技术。     

单增李斯特氏菌SureTect实时PCR检测方法的 比较研究

目的 评估食品中单增李斯特氏菌SureTect实时PCR检测方法的性能。     

环介导恒温扩增方法快速检测乳中单增李斯特菌

建立了一种快速检测灭菌乳中单增李斯特菌的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法。以hlyA基因作为靶基因,对人工污染乳中单增李斯特菌进行了LAMP方法的灵敏度试验,同时与PCR方法进行比较。并对单增李斯特菌和7种其他乳中常见致病菌进行了LAMP检测,以验证该方法的特异性。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的特异性强,检出限为42 mL-1,其灵敏度比普通PCR高10倍。并且检测时间比PCR更短,在1.5 h内即可完成扩增反应。此方法快速、特异、简单、灵敏,具有较高的推广价值。     

食品中单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金 试纸条方法的建立

目的 建立食品中单核增生李斯特氏菌快速检测PCR-免疫胶体金试纸条法。方法 通过设计特异性引物建立单增李斯特氏菌检测PCR方法并使用免疫胶体金技术建立PCR产物快速检测试纸条; 用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度与敏感度。使用新建方法对市售肉制品和乳制品中单核增生李斯特氏菌进行检测, 验证该方法在食品检测中的可行性。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度, 敏感度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。采集乳品样品131份, 阳性样品1份, 检出率1.53%; 肉制品224份, 阳性样品4份, 检测率1.79%。结论 建立的单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好, 敏感度高, 适用于食品中单增李斯特氏菌的检测。     

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增（saltatory rolling circle amplification,SRCA）技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70?种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明：所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×100?fg/μL,是传统聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法的1?000?倍,检出限为2.8×100?CFU/g,是传统PCR方法的1/1?000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB?4789.30—2016《食品微生物学检验?单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。     

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。