Isolation and identification of two novel umami and umami-enhancing peptides from peanut hydrolysate by consecutive chromatography and MALDI-TOF/TOF MS

Peanut hydrolysate produced by crude protease extract from Aspergillus oryzae HN 3.042 was found to elicit intense umami and umami-enhancing effect. Taste profiles, amino acid and organic acid composition of peanut hydrolysate and its separation fractions by ultrafiltration were evaluated. The results revealed that peanut hydrolysate was mainly low molecular weight compounds. Fractions of 1-3 kDa and below 1 kDa prominently contributed to the umami taste and umami-enhancing effect of the peanut hydrolysate. The two fractions were further purified, using gel filtration chromatography and reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC), in combination with sensory evaluation, to obtain a umami peptide and umami-enhancing peptide. The active peptides were identified as Ser-Ser-Arg-Asn-Glu-Gln-Ser-Arg (SSRNEQSR, 963.9 Da) and Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg (EGSEAPDGSSR, 1091.1 Da), by MALDI-TOF/TOF MS, respectively.     

武定鸡肉中鲜味肽分离鉴定及呈味特性

利用超滤分级、凝胶过滤色谱法和反相-高效液相色谱法对武定鸡肉中鲜味肽进行分离纯化,结合感官评价追踪鲜味最强烈的组分,以纳升高效液相色谱-串联质谱联用技术与固相合成法对鲜味肽进行鉴定和合成,进一步分析鲜味肽的序列来源及其呈味特征。结果表明：从武定鸡肉中分离鉴定出8 条多肽,分子质量范围为365.20～1 735.92 Da,其中LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL这3 条肽段具有明显的鲜味活性,阈值在0.062～0.250 mg/mL之间,是武定鸡肉鲜味的关键组分。     

不同底物浓度花生粕酶解产物特性的研究

花生粕是花生榨油后的副产物,压榨过程中高度变性导致蛋白利用率较低。本文通过生物发酵技术诱导米曲霉分泌蛋白酶水解花生粕,在不同底物浓度条件下酶解花生粕,对比酶解产物的蛋白回收率、水解度、总糖回收率、分子量分布、游离氨基酸组成,同时采用电子舌对富含呈味肽的酶解产物进行感官评价分析,探究不同底物浓度条件下发酵花生粕的酶解产物特性,并筛选适宜的酶解浓度。研究发现,发酵花生粕经不同底物浓度酶解后,蛋白回收率在70.68%~84.14%之间,水解度在30.04%~40.05%之间;酶解产物以小于1 ku的短肽为主(87.57%~90.21%),并含有较多游离氨基酸;在呈味特性方面,酶解液含有较强的鲜味。结果表明,在料液比为1:5时,获得较高的蛋白回收率、水解度以及较多小分子肽,鲜味评分也相对较高。     

乙醇萃取3种酶解产物鲜味肽的研究

以牡蛎、鸡肉和南极磷虾为原料,利用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合酶对其进行酶解,以感官评分、肽分子量分布和氨基酸组成为指标,考察乙醇萃取3种酶解产物鲜味肽过程中感官评分、肽分子量分布和氨基酸组成的变化。研究结果表明:90%乙醇萃取牡蛎、鸡肉和南极磷虾3种酶解产物的上清液均具有较强的鲜味,分子量在5ku以下的肽比例分别为93.00%,86.82%,87.86%。3种酶解产物中分子量10ku和5~10ku的肽,经过90%乙醇萃取后明显减少。90%乙醇萃取3种酶解产物的上清液小分子肽中含有较高比例的甜味和鲜味氨基酸。90%乙醇萃取方法可用于牡蛎、鸡肉和南极磷虾酶解产物中鲜味肽的快速萃取。     

白玉菇中鲜味肽的分离鉴定及呈味特性分析

采用超滤、凝胶渗透色谱及反相高效液相色谱结合感官引导,从白玉菇水提物中分离纯化出白玉菇鲜味最佳组分,通过超高效液相色谱-质谱联用技术从中鉴定鲜味肽,并将所鉴定的鲜味肽合成后通过人体感官评价对其呈味特性进行研究。结果表明：白玉菇水提物中含有6?种鲜味肽,即ELELQ、ELQSGNTY、NYNGGY、EAKVY、VANGGGFGAA、SLLQPL,鲜味阈值分别为0.16、0.19、0.31、0.38、0.44、0.63?mg/mL,且6?种肽的分子质量皆在1?000?Da以下;同时6?种合成肽具有鲜味增强作用,从其在味精溶液中的剂量-反应曲线可以看出,所鉴定的鲜味肽增鲜能力差异显著（P＜0.05）,其中NYNGGY、ELELQ的增鲜能力突出;6?种合成肽对鸡汤具有鲜味、咸味和甜味增强特性,其中ELELQ、NYNGGY、ELQSGNTY对鸡汤的味感提升效果最好。     

呈味肽的制备、纯化与鉴定

采用酶解法以鸡肉为原料进行鸡肉蛋白多肽的制备,通过葡聚糖凝胶柱层析法对混合多肽进行不同分子质量片断的分离,确定最优的分离填料为G25、洗脱液为乙醇-水,在此条件下,分子质量＜1 000 u的组分通过分离富集含量可达100%、分子质量＞5 000 u的组分含量达78%、分子质量1 000～5 000 u的组分含量达70%。通过感官评价、电子舌分析发现,不同分子质量片段多肽提供的风味侧重点不同,分子质量＜1 000 u的多肽热反应产物在醇厚感、嗜好性方面最优。利用高效液相色谱、液质联用仪对该肽段进一步纯化与鉴定,找到其中5条呈味肽,并采用固相合成法制备,经感官评价验证其呈味功能,发现在清水评价中,合成的5条多肽呈味效果以酸、甜、鲜味为主;在鸡粉溶液加香评价中,呈现鲜味最强的多肽为γ-L-Glu-L-Glu和γ-L-Glu-L-Val-Gly;呈现醇厚感最强的多肽为L-GSH。     

肉杂鸡鸡骨架酶解工艺优化及其分析评价

以肉杂鸡鸡骨架为原料,测定其基本成分和氨基酸组成,对蛋白质进行营养评价,发现鸡骨架是进行酶解的良好原料.从碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰酶和复合蛋白酶中筛选出鸡骨架酶解的最佳用酶,利用单因素实验和响应面法优化了鸡骨架酶解的工艺条件.结果表明:在温度50℃、pH7.0、酶添加量7000 U/g的条件下酶解4 h,酶解效率最高...     

酪蛋白双酶水解物ACE抑制肽的分离纯化

采用胃蛋白酶和胰蛋白酶依次对酪蛋白进行双酶水解,制备ACE抑制肽。水解物经截留分子质量6ku的超滤膜初步分离,再通过Sephadex G-15进一步纯化,体外测定各分离产物ACE活性的半数抑制质量浓度(IC50值)。纯化得到的各组分经毛细管电泳分析肽谱、Q-TOF LC/MS检测分子质量范围。结果显示：双酶水解产物IC50值为560μg/mL,超滤流出物IC50值为250μg/mL;Sephadex G-15分离得到3个组分,组分Ⅰ的IC50值为123.41μg/mL,含有19个肽段;组分Ⅱ的IC50值为66.67μg/mL,含有14个肽段;组分Ⅲ的IC50值为64.29μg/mL,含有5个肽段。Q-TOF LC/MS测得纯化组分的分子质量范围为400～800u。     

水产蛋白酶解制备鲜味肽

以3种不同类别的水产蛋白为原料,制备具有风味提升的短肽。通过比较酶解产物的感官特点,确定m鲢鱼:m对虾:m扇贝为1:1:1;采用风味蛋白酶与复合蛋白酶双酶水解,添加两酶质量比为1:1。采用Box-Behnken设计和响应面法(RSM)优化酶解水产蛋白的工艺,以水解度和感官评分为指标,探讨酶与底物比([E]/[S])、酶解温度和酶解时间对鲜味肽的感官影响。结果表明：水产蛋白制备鲜味肽的最佳工艺为[E]/[S]7.5‰、底物质量浓度30g/100mL、自然pH值、酶解温度56℃、酶解时间5.9h。验证实验表明,该条件下水产蛋白的水解度和鲜味肽的感官评分分别为56.32%和6.8,与模型的预测值(55.17%和6.9)基本符合。酶解液超滤分离出4种组分的鲜味肽,将其分别进行Maillard反应。表明分子质量2.5～5kD鲜味肽Maillard反应后鲜味浓郁,无腥苦味。     

鸡汤及鸡肉酶解液中游离氨基酸及呈味特性的对比分析

为对比分析酶解液与鸡汤中游离氨基酸的组成及含量,采用氨基酸自动分析仪分析检测鸡汤及鸡肉酶解液中的游离氨基酸,并用电子舌分析两者滋味轮廓。结果表明,酶解液中的游离氨基酸总含量相对鸡汤显著增加,两者呈味氨基酸占总游离氨基酸（total free amino acids,TFAA）的比例相近。鸡汤中味道强度值最大的为组氨酸,其次为谷氨酸,酶解液中味道强度值较大的除谷氨酸为呈鲜味的氨基酸外,其余均为呈苦味氨基酸。鸡汤中呈鲜味和甜味氨基酸占TFAA比例之和与呈苦味氨基酸相近,而酶解液中呈苦味氨基酸占TFAA比例多达72.60%,可见鸡汤整体滋味以鲜甜为主,而酶解液整体滋味以苦味为主。电子舌主成分分析结果表明鸡汤与酶解液滋味有显著差异。     

蚕蛹蛋白水解前处理和水解产物鲜味增效的研究

研究超声波、亚硫酸钠、酸等前处理对蛋白酶解效率的影响,并探讨谷氨酸钠和氯化钠对酶解产物的滋味的影响。实验表明,低浓度的亚硫酸钠处理能改善对蚕蛹蛋白的水解效果,而酸和超声波处理能显著提高蚕蛹蛋白回收率和水解度,其中超声处理效果最佳,使蚕蛹蛋白回收率和水解度分别提高5%和3%（p<0.05）。前处理都能提高酶解产物中小肽的比例,分子量小于1000 u的小肽占75%以上,1000~3000 u的组分占20%左右;其中超声前处理,分子量小于1000 u的小肽从占比66.44%提高到77.58%。通过单纯形重心设计,探讨在酶解液中氯化钠和谷氨酸钠的相互作用对滋味的影响。氯化钠和谷氨酸钠的浓度对超声前处理的酶解产物的鲜味有显著性的影响（p<0.05）,当味精和氯化钠的浓度分别是0.37%和0.85%时,鲜味增效达到最佳值,感官评分为7.3分。     

膜分离鸡骨素酶解液美拉德反应产物的初步研究

本研究对鸡骨素酶解液美拉德反应产物(MRPs)膜分离后的不同组分进行了初步分析。首先鸡骨素酶解液经美拉德反应制得鸡骨素酶解液MRPs,再利用膜分离技术将鸡骨素酶解液MRPs进行微滤、超滤、纳滤和反渗透,从而得到不同分子量范围的鸡骨素酶解液MRPs组分;然后通过吸光度和感官仪器分析,检测了鸡骨素酶解液MRPs各组分的褐变程度、风味色泽变化;通过对还原力、ABTS+自由基清除力、AEC抑制率、氧自由基吸收能力(ORAC)及对环状质粒DNA的保护能力的检测,研究了鸡骨素酶解液MRPs各组分的抗氧化特性,并最终对各组分进行了综合评价。结果表明:鸡骨素酶解液美拉德反应中引起褐变的物质分子量大于3 kDa,反应中间产物的分子量集中在0.3~1 kDa;鸡骨素酶解液经美拉德反应后风味得到改善,抗氧化活性显著提高(p < 0.05),其中呈味物质主要集中在微滤和纳滤组分,鸡骨素酶解液MRPs中各组分与未分离原液相比抗氧化活性有所降低,但都显著高于鸡骨素酶解液(p < 0.05);综合评价显示,鸡骨素酶解液美拉德反应原液的综合得分最高,鸡骨素酶解液MRPs各组分得分也高于鸡骨素和鸡骨素酶解液。     

罗非鱼副产物蛋白水解肽的呈味分析

为了探究罗非鱼副产物蛋白水解物中滋味活性物质的来源,该研究以罗非鱼的鱼皮、鱼头和鱼骨为原料,采用中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶分别对三种副产物进行酶解,分析比较水解度、分子量、前体蛋白与滋味活性物质的关系。结果表明：三种罗非鱼副产物经过风味蛋白酶水解酶水解8 h后获得最高水解度,分别为14.29%、23.7%和31.86%。经过木瓜蛋白酶水解的副产物酶解液均呈现出显著苦味或酸味,而鱼头经过碱性蛋白酶酶解得到的水解产物具有鲜味,鱼骨则经过菠萝蛋白酶水解得到鲜味,鱼皮经过中性蛋白酶水解表现出鲜味和酸味,但鱼头却呈现出苦味。通过LC-MS/MS鉴定,胶原蛋白、肌原纤维蛋白以及肌浆蛋白是罗非鱼副产物酶解液滋味活性肽的重要味觉活性前体,这些滋味肽的分子量大部分小于1500 u,肽段中疏水性氨基酸残基对罗非鱼副产物滋味的形成具有重要作用,其中蛋氨酸在酶解液的鲜味的形成中起重要贡献。     

组合酶对复合骨素酶解液呈味物质的影响

为探究组合酶对牛骨素和鸡骨素的复合骨素酶解液呈味物质的影响,选取四种组合酶(木瓜蛋白酶+风味蛋白酶、菠萝蛋白酶+风味蛋白酶、碱性蛋白酶+风味蛋白酶、复合蛋白酶+风味蛋白酶)制备复合骨素酶解液,测定四种复合骨素酶解液的水解度、游离氨基酸、呈味核苷酸、味精当量(Equivalent umami concentration,EUC)、肽分子量分布等呈味物质指标,并进行对比分析。结果表明:碱性蛋白酶+风味蛋白酶(Alkaline proteinase+Flavourzyme,A+F)和复合蛋白酶+风味蛋白酶(Protamex+Flavourzyme,P+F)酶解液的水解度最大,分别为10.67%和11.27%;对呈味游离氨基酸组成分析发现,A+F酶解液鲜味氨基酸、苦味氨基酸、无味氨基酸含量最高,A+F和P+F酶解液总游离氨基酸含量最高;四种酶解液中肌苷酸较另两种核苷酸含量高,A+F酶解液总核苷酸含量最高;比较四种酶解液味精当量,A+F酶解液EUC值最大;A+F和P+F酶解液中分子量<1000 Da肽段含量最高,制备复合骨素酶解液的呈味效果更好;主成分分析表明A+F组合酶综合得分最高,A+F组合酶为美拉德反应提供丰富反应底物。     

不同蛋白酶制备鹅肉呈味肽的对比分析

以鹅肉为原料,采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶制备呈味肽,对比分析4 种酶解液中的水解度、寡肽含量,采用氨基酸自动分析仪对酶解液游离氨基酸组成进行测定,并利用电子舌和感官评定方法对酶解液的鲜味等味道进行滋味评定。结果表明：45 ℃恒温水浴酶解6.5 h,加酶量1 200 U/g、pH 7.0、固液比1∶3（g/mL）的条件下,木瓜蛋白酶酶解液水解度最大且寡肽质量分数最高,其次是中性蛋白酶,鹅肉蛋白水解度达到29.69%,寡肽质量分数达到0.18%。此外,中性蛋白酶酶解液的风味最好。中性蛋白酶酶解后产生的游离氨基酸类型丰富,谷氨酸和丙氨酸的含量高,最终酶解液整体鲜味浓郁,并伴有酸味。因此,确定酶解鹅肉蛋白的最佳用酶为中性蛋白酶。     

Soy Sauce and Its Umami Taste: A Link from the Past to Current Situation

ABSTRACT: Soy sauce taste has become a focus of umami taste research. Umami taste is a 5th basic taste, which is associated to a palatable and pleasurable taste of food. Soy sauce has been used as an umami seasoning since the ancient time in Asia. The complex fermentation process occurred to soy beans, as the raw material in the soy sauce production, gives a distinct delicious taste. The recent investigation on Japanese and Indonesian soy sauces revealed that this taste is primarily due to umami components which have molecular weights lower than 500 Da. Free amino acids are the low molecular compounds that have an important role to the taste, in the presence of sodium salt. The intense umami taste found in the soy sauces may also be a result from the interaction between umami components and other tastants. Small peptides are also present, but have very low, almost undetected umami taste intensities investigated in their fractions.     

炖煮鸡汤中多肽与鲜味构效关系

以传统炖煮鸡汤为对象,研究多肽与鲜味之间的构效关系。将炖煮3 h的鸡汤利用10、5、3 kD的超滤膜分离,取味道鲜美的分子质量小于3 kD的组分进行高效液相色谱-质谱法多肽组分分析,获得了93 条多肽序列。通过分析发现：加热降解产生的多肽序列中甜鲜氨基酸的比例高,强疏水性氨基酸的比例低;加热降解过程中肽键断裂具有选择性,亲水氨基酸形成的肽键更易断裂。鲜味多肽主要来源于肌肉蛋白,其次是胶原蛋白、酶、抗体等活性成分。     

Alcalase降解水不溶性鸡肉蛋白规律及其产物清除DPPH活性研究

研究了Alcalase降解水不溶性鸡肉蛋白的规律及其产物清除DPPH自由基活性。结果表明,随酶解时间延长,可溶性蛋白质、氨基酸含量不断增加,而肽含量则在水解前8h达到最大,随后不断降低;肽的分子量分布趋势总体表现为大分子量的肽逐渐减少,小分子量肽的含量逐渐增多,肽分子量分布图中肽峰值不断向后推移;Alcalase对分子量在3000～15000Da间的肽段降解能力较弱,水解24h后,这部分肽占总肽量的比值仍为89.93%。水不溶性鸡肉蛋白Alcalase酶解产物有明显的清除DPPH活性,其清除DPPH活性在酶解4h时达到最大,随后不断下降;对于同一酶解时间的产物,浓度越大,其清除DPPH活性越强,但其清除DPPH能力并不与酶解液浓度成倍数关系。     

Alcalase酶解狼山鸡肉蛋白规律

以狼山鸡为实验材料,分析Alcalase酶解鸡肉蛋白规律。结果表明：酶解鸡肉蛋白的最适酶解温度为45 ℃、酶添加量为2.0 U/g、酶解时间为4 h;酶解过程中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白有较多的氨基酸释放,并且可溶性氮也有大量的累积,酶解产物的分子质量主要集中在30～50 kD之间;在酶解产物中含量最高的氨基酸分别为天冬氨酸和谷氨酸,并且在酶解产物中亲水性氨基酸（hydrophilic amino acid,HLAA）与疏水性氨基酸（hydrophobicamino acid,HBAA）比值在1.41～1.52之间;通过对酶解产物游离氨基酸营养价值的分析,在不同酶解时间的酶解产物中含有丰富的必需氨基酸,该必需氨基酸指数与联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（Food AgricultureOrganization/World Health Organization,FAO/WHO）推荐的成人理想氨基酸模式相类似。     

鸡肉蛋白酶解条件及产物降解规律

采用木瓜蛋白酶水解鸡肉蛋白,通过单因素实验和正交实验确定水解鸡肉蛋白的最适条件,并在此水解条件下酶解24 h,研究水解过程中酶解液中游离氨基酸含量和肽分子质量分布的变化规律。结果表明,最佳的酶解条件为:温度45℃,pH6.5,酶用量6.0%,固液比1∶2,水解时间6 h;酶解产物中游离氨基酸种类齐全且含量较高,水解过程中,游离氨基酸总量变化呈增长的趋势,16 h后变化不大;酶解液的肽分子质量都集中在3 000Da以下,酶解过程中大分子质量肽不断减少,小分子质量肽不断增加;酶解24 h后,分子质量小于1 000 Da的小分子肽和氨基酸含量可达97.19%。