流加操作与稀释添加耦合辅助高浓度变性蛋白质复性动力学

研究了流加操作与稀释添加耦合辅助高浓度变性还原溶菌酶的复性,建立了相关的过程动力学模型.利用三态复性的过程模型对实验数据进行了拟合,获得了较好的拟合效果.利用模型分析了复性过程的动力学特性,结果表明,两者耦合可在较低的盐酸胍浓度(1 mol•L^-1)存在下使较高浓度的（5 mg•ml^-1）变性溶菌酶获得80%以上的复性收率;并且发现添加剂乙酰胺的辅助复性作用与盐酸胍相同,降低盐酸胍浓度,适当提高乙酰胺浓度即可使聚集体生成速率常数最小,酶的复性收率最大;但甘油与盐酸胍具有协同作用,只有在适当的盐酸胍浓度下添加甘油才可获得理想的复性效果.     

青海血蜱重组rHq002蛋白包涵体的纯化

目的 对青海血蜱重组rHq002蛋白包涵体进行复性及纯化.方法 将重组质粒pET-30a-Hq002转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组Hq002蛋白;超声破碎菌体,收集细胞碎片,用PBS缓冲液和低浓度尿素进行多次洗涤;洗涤后的包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,稀释法进行蛋白复性;用镍离子亲...     

高浓度变性-还原溶菌酶的流加复性动力学特性

研究了高浓度变性-还原溶菌酶的流加复性过程动力学特性,重点考察了影响复性速率和复性收率的主要因素,包括盐酸胍浓度、酶浓度和氧化还原剂浓度.结果表明,与直接稀释复性相比,流加操作可有效降低肽链分子间聚集,提高蛋白质的复性收率;在流加复性条件下,随着酶浓度的提高,复性速率和复性收率均有所下降,但适当提高复性液中盐酸胍浓度仍可获得高浓度蛋白质的高复性收率.另外,随着变性酶浓度的提高,需要适当提高复性液中氧化型谷胱甘肽浓度,以加快溶菌酶分子内二硫键的形成,提高复性反应速度.     

人工伴侣和盐酸胍促进溶菌酶复性的协同效应

研究了表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)加 β -环糊精 (β -CD) (人工伴侣系统 )和盐酸胍对高浓度变性 -还原溶菌酶氧化复性的影响 ,利用基于二态复性模型的表观动力学模型分析了溶菌酶的复性过程 .结果表明 ,存在最佳盐酸胍浓度 ,使酶的复性率最大 ;当盐酸胍浓度一定时 ,提高人工伴侣系统的浓度使复性反应速率常数增大、逆反应速率常数降低 ,从而提高复性收率 ,证明人工伴侣和盐酸胍对促进变性溶菌酶复性具有协同效应 .在最佳盐酸胍浓度和较高浓度的人工伴侣存在下 ,6 0min内可使浓度为 1.0 5mg·ml^-1的变性酶复性收率达到81% ,而相同条件下的自发复性收率仅为 49% .     

人工分子伴侣复性体系辅助溶菌酶复性的研究

研究了人工分子伴侣复性体系中各种因素对溶菌酶复性效果的影响.当缓冲液浓度为23 mmol/L、pH值为8.1、以半胱氨酸为二硫键重排剂时,对人工分子伴侣辅助复性效果较佳.人工分子伴侣体系(CTAB、β-CD和Cysteine)的复性率比只加Cysteine的体系提高约40%,比添加β-CD和Cysteine的体系提高约20%.同时发现当溶菌酶浓度较高时,增加盐酸胍浓度可以提高蛋白质的复性率.     

重组人γ-干扰素包涵体稀释复性

采用稀释法研究了重组人γ-干扰素包涵体复性条件,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度,同时对加样操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件.结果表明,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,在4℃、pH值8.0、脲浓度1.0mol•L^-1、蛋白浓度0.1mg•ml^-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人γ-干扰素的活性为2.39×10⁵ IU•ml^-1,比活达2.21×10⁷ IU•mg^-1.     

重组人EC-SOD包涵体的稀释复性及重折叠后蛋白的纯化

目的确定重组人ECSOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法。方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的基本条件。采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparinsepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异。结果最佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5molL,精氨酸浓度大于0.3molL,GSH∶GSSG=4∶1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低。IMAC和Heparinsepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparinsepharose纯化效率较高。结论确定了重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的最佳条件及复性后蛋白纯化的方法。     

重组瑞替普酶包涵体制备及其体外复性

将携带重组瑞替普酶(reteplase, rt-PA)的质粒成功转化到大肠杆菌BL21(DE3)后,诱导表达获得包涵体,考察了诱导剂浓度、培养温度和培养时间等条件对目标蛋白表达量的影响。在此基础上,对高效表达的rt-PA包涵体体外复性过程进行了详细研究。首先利用单因素实验考察了复性液pH、GSH浓度、GSH/GSSG比例、蛋白浓度等各种复性条件对复性效果的影响;并结合正交实验设计,进一步研究了高蛋白浓度下复性后rt-PA酶活变化情况。以0.2 mmol·L^-1 IPTG诱导,在33℃下培养6 h,每升发酵液约可获得1.7 g粗制包涵体。适宜的复性条件为蛋白浓度50 mg·ml^-1,pH 10.0,GSH浓度1 mmol·L^-1,GSH/GSSG比例8,复性收率为87.2%。影响高蛋白浓度下rt-PA复性的关键因素为复性液初始pH及GSH浓度,在800 mg·ml^-1蛋白浓度下复性后rt-PA比活可达7.54×10⁴ IU·mg^-1,荧光光谱分析结果表明复性后rt-PA恢复了其天然态结构。     

重组人成骨蛋白-1复性条件的优化

目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4～0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。     

抗RBC/HBsAg ds-diabody包含体复性条件的优化

目的优化以包含体形式表达的抗RBC/HBsAg ds-diabody的复性条件。方法在大肠杆菌BL21/λDE3中诱导表达抗RBC/HBsAg ds-diabody,收获包含体,变性后,分别经透析复性和稀释复性方法复性,并以两种特异性结合活性检测复性效果,对pH值、复性时间和温度进行优化。结果包含体经变性后,pTH-dsR30KD特异蛋白占总蛋白的85%,pTdsR-H30KD特异蛋白占总蛋白的96%;ds-diabody抗体以稀释复性效果较好;在碱性(pH8.8～10)、低温(4℃)条件下复性72h效果最好。结论优化了抗RBC/HBsAg ds-diabody包含体的复性条件。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

Refolding of lysozyme at high concentration in batch and fedbatch operation

Based on optimization of denaturing conditions and the character of time course of protein refolding, renaturation by dilution in batch and fed-batch operation to improve yield as well as the initial and final protein concentrations has been studied. The optimum DTT in denatured solution was 30 mM. Urea can suppress protein aggregation to sustain pathway of correct refolding at high protein concentration. Fed-batch operation was better than batch dilution with comparison of yield recovery in large-scale downstream processes. Under our research condition in fed-batch operation, lysozyme was successfully refolded from initial protein concentration of up to 40 mg/mL by dilution 20-fold, the yield recovery was nearly 60%.     

Refolding of recombinant human interferon-γ by hydrophobic interaction chromatography

重组人γ-干扰素（rhIFN-γ）在大肠杆菌中高效表达,并形成包涵体.利用疏水作用层析（HIC）法对rhIFN-γ 进行复性.采用了等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对rhIFN-γ复性的影响.在优化的线性尿素梯度复性条件下,尿素浓度在10个柱体积内从6 mol•L^-1下降到2 mol•L^-1,流速为1 ml•min^-1、上样量为0.568 mg时,rhIFN-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量收率为36%,比活达1.9×10⁸ IU•mg^-1.     

疏水层析法复性重组人γ-干扰素

重组人γ-干扰素（rhIFN-γ）在大肠杆菌中高效表达,并形成包涵体.利用疏水作用层析（HIC）法对rhIFN-γ 进行复性.采用了等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对rhIFN-γ复性的影响.在优化的线性尿素梯度复性条件下,尿素浓度在10个柱体积内从6 mol•L^-1下降到2 mol•L^-1,流速为1 ml•min^-1、上样量为0.568 mg时,rhIFN-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量收率为36%,比活达1.9×10⁸ IU•mg^-1.