人甲状旁腺素N-端34肽基因的合成、克隆和融合表达

目的构建重组人甲状旁腺素N-端34(PTH34)肽的大肠杆菌融合表达菌株,并对其表达产物进行检测。方法选用大肠杆菌偏爱密码子,设计优化的人甲状旁腺素N-端34肽基因序列,通过6个DNA片段分段合成、片段连接、PCR扩增,经TA克隆到pMD18载体中,经测序验证,构建GST融合表达载体。结果经SDS-PAGE检测PTH(1-34)肽与GST蛋白的融合表达,经Westernblot分析具有免疫活性,通过GST亲和层析和Xa因子酶切,利用小分子蛋白电泳可检测到PTH(1-34)肽。结论已获得了能表达GST-PTH(1-34)融合蛋白的菌株。表达产物具有免疫活性,且能被Xa因子消化得到PTH(1-34)肽。     

天蚕素A-蛙皮素杂合肽突变体的构建、表达及其抗菌活性

目的构建天蚕素A(1～8)-蛙皮素(1～12)杂合基因抗菌肽(CA-MA杂合肽)突变体,在大肠杆菌中融合表达,并进行抗菌活性检测。方法采用PCR体外定点突变技术,设计1对方向相反的引物,其中1个引物引入突变点,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行重组表达质粒pGEX-4T-1-CA-MA的PCR扩增,使CA-MA杂合肽第16位密码子由AGT突变为TGG。将扩增片段自身连接,构建CA-MA杂合肽突变重组表达质粒pGEX-4T-1-W16-CA-MA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达突变体蛋白W16-CA-MA,并对表达产物进行纯化。分离GST融合蛋白后,进行抗菌活性检测。结果重组突变表达质粒DNA测序结果表明,在预期位点发生了突变;突变蛋白在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的18%;纯化后蛋白纯度可达75%以上,并具有一定的抗菌活性。结论已成功获得了具有抗菌活性的杂合肽突变体W16-CA-MA。     

人体β-防御素-3突变基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的对人体β-防御素-3基因进行定点突变,并在E.coli中表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码β-防御素-3成熟肽的cDNA,测序正确后,设计含突变位点的引物,用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA进行定点突变,将突变产物克隆至pUC18,并在E.coli中融合表达。结果测序结果表明,经RT-PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GenBank中报道的序列完全一致。经过突变,β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA,其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E.coli中诱导表达后,可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论已成功克隆并表达了β-防御素-3突变体基因。     

TRAIL与导向肽融合基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性

目的获得具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白,提高TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。方法构建TRAIL与导向多肽PEPHC1的融合基因,克隆入质粒pGEM-3zf(-)中进行测序,序列正确后,亚克隆入表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达。结果42℃诱导4h,融合基因得到了表达,SDS-PAGE表明目的蛋白占菌体总蛋白的15%以上,以包涵体形式存在。经包涵体洗涤、变性、复性,并经离子交换层析柱纯化后可得到融合蛋白PE-TRAIL,经体外试验证明具有生物学活性。结论成功克隆并表达了具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白。     

十二指肠贾第虫α-6贾第素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化十二指肠贾第虫α-6贾第素(α-6 Giardin)。方法以十二指肠贾第虫的c DNA为模板,PCR扩增α-6 Giardin基因片段,连接至p MD18-T载体,得到重组克隆质粒p MD18-T-α-6,将双酶切后得到的目的片段连接至p ET-28a表达载体中,得到重组表达质粒p ET-28a-α-6,转化至E.coli Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达目的蛋白α-6 Giardin,收集菌体,离心后进行SDS-PAGE及Western blot鉴定,并利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合的α-6 Giardin蛋白。结果质粒p ET-28a-α-6经双酶切鉴定,证明构建正确;表达的目的蛋白α-6 Giardin为带His标签的包涵体蛋白,相对分子质量约40 000,可与鼠抗His单抗特异性结合,具有良好的反应原性;纯化的重组α-6Giardin融合蛋白相对分子质量约40 000,纯度可达80%。结论成功克隆、表达并纯化了十二指肠贾第虫α-6Giardin蛋白,为十二指肠贾第虫α-6 Giardin进一步的功能研究奠定了基础。     

重组人成骨蛋白-1基因在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达

目的　研究重组人成骨蛋白 -1(rhOP -1)在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达。方法　利用RT -PCR技术 ,从正常胎儿肾组织总cDNA中扩增得到rhOP- 1成熟肽基因片段 ,再将rhOP- 1成熟肽基因克隆于原核融合表达载体pGEX- 4T- 2中 ,构建表达质粒pCCBC- OP- 1,并转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)中 ,在发酵过程中不添加任何诱导剂。表达产物经SDS -PAGE分析。结果　扩增的目的基因序列与文献报道一致。表达的目的蛋白相对分子质量为 14 0 0 0 ,表达量达到菌体蛋白的 4 0 %。结论　克隆了人OP -1成熟肽基因 ,并实现了rhOP- 1的非诱导高效表达。     

HTPP-MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

通过双酶切、连接、转化等方法将肝靶向穿膜肽-家蝇天蚕素（HTPP-MDC）融合基因克隆至原核表达载体pET32a（＋）上,构建重组表达质粒HTPP-MDC/pET32a。重组质粒转化E.coli BL21（DE3）后,以IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明重组融合蛋白得到了可溶性表达,Western blot杂交证实了表达蛋白的抗原活性。为HTPP-MDC的生物学活性研究及产业化开发奠定了基础。     

HBsAg/GM-CSF融合蛋白的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达HBsAg/GM-CSF融合蛋白。方法利用PCR扩增HBsAg和GM-CSF基因,通过15个氨基酸的连接肽将两个片段连接,获得融合基因S-GM,克隆入酵母穿梭质粒pPIC9K中。将重组质粒9K-S-GM电转化毕赤酵母后,G418筛选,甲醇诱导,HBsAg/GM-CSF融合蛋白表达。经SDS-PAGE检测表达水平,Western blot检测表达产物特异性。结果PCR扩增的片段与预期大小一致,HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中获得了表达。Western blot检测,该融合蛋白同时具有HBsAg和GM-CSF的特异性。结论该融合蛋白的获得为提高乙肝疫苗的免疫原性奠定了科学基础。     

CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒,构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CTP-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位。结果重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确。37℃,1 mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上。FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性。结论已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础。     

重组人肽抗生素hPAB-β的初步纯化

目的　探索重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,为制备高纯度、高活性的重组hPAB β奠定基础。方法　将构建的含pQE32 CP hPAB β重组质粒的基因工程菌扩大培养 ,诱导表达后所得菌体经溶菌酶法裂解 ,鉴定融合蛋白表达形式 ;以含融合蛋白的溶液作为纯化的初始样品 ,采用Ni NTAresin亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,用CNBr裂解 ,利用SephadexG 5 0、Bio gelP6DG凝胶进行分子筛层析 ,利用Macro PrepHighS进行阳离子交换层析 ,对层析峰行Tris Tricine电泳分析。结果　融合蛋白以包涵体形式存在 ;亲和层析获得了纯度为 82 .6 %的融合蛋白 ,CNBr作用 2 0h可完成融合蛋白的裂解 ;目的肽经纯化后 ,纯度达 95 %以上。结论　已初步建立了重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,并获得了高纯度的肽抗生素hPAB β。     

多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白的原核表达及其生物活性

目的原核表达多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法应用PCR法扩增Arg9-VP3序列,与载体pET-43.1a连接后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA纯化后,进行肠激酶裂解、超滤浓缩,并检测其生物活性。结果重组表达质粒pET-43.1a-Arg9-VP3经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达。纯化的融合蛋白纯度达90%以上,可抑制HeLa细胞增殖。结论已成功地在大肠杆菌中表达了多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,纯化的融合蛋白具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

小鼠载脂蛋白A-Ⅰ的原核表达及抗血清的制备

目的原核表达小鼠载脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ),并制备抗血清。方法应用RT-PCR方法从小鼠肝脏中扩增ApoA-Ⅰ基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后,免疫家兔,制备抗血清。结果扩增的ApoA-Ⅰ基因经测序,表明与GenBank中报道的序列(NM_009692)完全相同。重组表达质粒经酶切鉴定,证明构建正确。表达的ApoA-Ⅰ融合蛋白相对分子质量约为32000,表达量占菌体总蛋白的17%。纯化的融合蛋白纯度达90.7%,可与抗His·Tag单抗发生特异性反应。制备的抗血清可识别ApoA-Ⅰ融合蛋白,效价可达1∶105。结论已在大肠杆菌中表达了小鼠ApoA-Ⅰ,并制备了较高效价的抗血清。     

小鼠MIF基因的原核表达及纯化

目的克隆小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因,在原核系统中表达并进行初步纯化,为研究MIF的功能奠定基础。方法提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR技术扩增MIF基因,克隆入pMD18-T载体,酶切鉴定及测序后,再定向插入原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果克隆得到的目的基因片段大小与预期相符,测序结果与GenBank中报道的序列完全一致。重组MIF蛋白相对分子质量约为15000,以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40%,且具有良好的反应原性。经初步纯化后,纯度达95%以上。结论已成功克隆了小鼠MIF基因,并在原核系统中表达了重组蛋白,纯化的蛋白纯度较高,可用于后续试验。     

TRAIL_(114～281)-IL-24融合蛋白的原核表达及其体外抗肿瘤细胞活性

目的原核表达肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)114～281肽和人白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)融合蛋白,并检测其体外抗肿瘤细胞活性。方法以人外周血单个核细胞总RNA为模板,PCR扩增TRAIL114～281和IL-24基因,经T4DNA连接酶连接成融合基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a/TRAIL114～281-IL-24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白TI经层析法纯化后,进行Western blot分析,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,caspase3活性检测试剂盒检测其对不同肿瘤细胞caspase3活性的影响。结果重组表达质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;TI融合蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度可达95%,且可与鼠抗人IL-24抗体发生特异性反应;经复性的蛋白能明显抑制人宫颈癌上皮细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并显著提高肿瘤细胞的caspase3活性。结论已在大肠杆菌中表达了TRAIL114～281-IL-24融合蛋白,其具有诱导部分肿瘤细胞凋亡的活性。     

抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素基因的克隆与表达

目的扩增抗癌胚抗原单链抗体(CEA-ScFv),与绿脓杆菌外毒素(PE40)进行重组及原核表达,旨在进一步研究重组蛋白CEA-ScFv-PFA0的靶向抗肿瘤作用。方法分别扩增抗癌胚抗原单链抗体的重链区、轻链区,用overlap PCR按照VH-VL的顺序连接,克隆至pMD18T载体中。再将VH-VL基因片段与含有.PE40的表达载体pET28a连接,转化B121(DE3),IPTG诱导表达。结果经DNA测序,其结果与设计完全相符。SDS-PAGE分析,在相对分子质量66000处可见明显表达带,表达量可占菌体蛋白总量的13％以上。免疫印迹表明重组蛋白具有PF40的抗原特异性。结论抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素的成功克隆与表达,为进一步研究其生物活性奠定基础。     

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因片段(363～505位氨基酸)的原核表达质粒,并鉴定所表达蛋白的反应原性。方法以含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T-pp65质粒为模板,PCR扩增pp65基因第1087～1515位核苷酸片段,酶切后插入pET-21a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,纯化后进行Western blot鉴定。结果酶切分析和测序证明原核表达质粒pET-21a(+)-pp65构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,以1.0mmol/L IPTG诱导5h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功构建了HCMV pp65基因片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

LTB-MOMP融合基因表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)融合基因(LTB-MOMP)的表达载体,并在原核细胞中表达融合蛋白。方法应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因,经与柔性肽连接后,插入pET-28a载体中,酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达,并纯化目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性。结果重组工程菌可以表达相对分子质量约为54000的LTB-MOMP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的42%,LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性。结论已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体,并在原核细胞中获得表达。     

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。