γ-氨基丁酸受体基因的系统性调控网络

提出一种多学科交叉结合的策略,试图初步获得系统性调控γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)受体基因的转录因子线索.利用基于功能基因组学方法的DNA元件百科全书计划已发表的数据,系统性地获得GABA受体基因的开放染色质序列,并以此作为固相化探针,捕获与其特异性相互作用的蛋白质分子,并利用质谱分析鉴定蛋白.结果发现,对不同脑区获得的核蛋白,探针都能捕获到同样的特异性条带,然而,作为对照的天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体基因相关的开放染色质探针,在不同脑区中并未检获上述特异信号,说明结合蛋白是特异的.质谱分析表明,与GABA受体基因相关的开放染色质特异相互作用的蛋白是核膜血影重复蛋白-1(nuclear envelop spectrin repeatprotein-1,Nesprin-1),又称synaptic nuclear envelope-1(SYNE-1).进一步的调控网络生物信息学分析表明,Nesprin-1可能与MAFA、IRX2、BCL6、CEBPA以及RP58等转录因子形成复合物,并与GABA受体基因GABRA5、GABRA6、GABBR1和GABBR2等共表达.表明GABA受体基因在不同脑区是通过相同的转录调控机制进行表达的,Nesprin-1可能与MAFA、IRX2、BCL6、CEBPA以及RP58等转录因子形成复合物进而调控GABA受体基因表达,该特异的转录因子调控网络有望用于诱导多能干细胞或是前体细胞直接分化为GABA能神经元.     

一株伯克氏菌中两个阿魏酸酯酶的比较分析

本文从NCBI数据库中检索得到Burkholderia phytofirmans PsJN的两个阿魏酸酯酶基因序列,分别标记为BpfaeI和Bpfae2,运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其二级和三级结构进行预测。结果表明,Bpfael的基因全长为1671bp,该基因编码的氨基酸为556aa,此蛋白质的等电点为8.33,分子量为59978.22Da。Bpfae2的基因全长为1734bp,该基因编码的氨基酸为577aa,此蛋白质的等电点5.42,分子量为59339.25Da。序列比对结果表明,Bpfael与Burkholderia xenovorans同源性最高为90%。Bpfae2与Burkholderia glumae同源性最高为83%,这两个阿魏酸酯酶蛋白的同源率为29%。另外对这两个阿魏酸酯酶的立体结构进行了同源模拟。     

家蚕znfhit基因的克隆表达及序列分析

在对家蚕蛹 cDNA文库的测序中发现了znfhit(zinc finger HIT)的 EST序列(GenBank登录号 DY230769).经过比对发现znfhit全长为1019bp,由297bp的 5'端非编码区序列(5'UTR)、462bp的开放读码框(ORF)和260bp的3'端非编码区序列(3'UTR)组成.将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,此基因由3个外显子和2个内含子组成.ZNFHIT蛋白的疏水性最大值为1.533,最小值为-3.267,且不含跨膜区域.用PCR方法扩增获得znfhit基因,将其克隆至质粒pET-28a上,构建重组质粒pET-znfhit,并在大肠杆菌中大量表达,经镍离子亲和层析纯化得到重组蛋白,质谱鉴定其分子量为21.11KD,为后续研究其功能提供了条件.     

拟南芥肌醇- 1-磷酸合酶类蛋白基因的克隆表达

以野生型拟南芥总RNA为模板,逆转录PCR反应获得拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因cDNA（AtMIPS1）,开放读码框为1533bp,编码510个氨基酸．与已报道物种MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,AtMIPS1与植物MIPS基因的氨基酸同源性和相似性较高达86％-90％与95％-96％,并含有MIPS基因的保守区域“334SYNHLGNNDG”．将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET28a（＋）原核表达载体上,SDS—PAGE结果表明：在0．12g／LIPTG诱导2h的条件下得到最佳的蛋白表达效果,AtMIPS1的成功表达为其功能研究打下基础．     

TALEN表达载体构建技术研究进展

转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALEN) 是最新出现的基因组定点修饰技术之一。该技术在应用过程中为保证靶点序列的特异性, 编码转录激活因子样效应物(TALE)结构域的序列一般较长,这使得TALEN表达载体的构建成为该技术的一个关键步骤和应用中的主要瓶颈,为此发展了多种TALEN表达载体构建方法。本文主要对其中常见的Golden Gate法、REAL法、单元组装法、FLASH法、ICA法、LIC法等方法及其研究进展进行了总结。随着TALEN表达载体构建方法的进一步丰富和普及,该技术必将在生物基因功能研究、农作物和家畜性状改良、人类遗传疾病治疗方面展现出广阔的应用前景。       

家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体 (low molecular mass 30 kDa lipoprotein 19G1 precursor)的EST序列(GeneBank登录号: AY568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771 bp,与基因组比对后发现该基因的ORF不含内含子,由单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白属于家蚕30K蛋白家族,预测分子量约为29.5 kDa ,等点电为7.29;信号肽分析显示该蛋白很可能存在信号肽.根据该基因ORF进行引物设计,以家蚕基因组为模板,PCR扩增获得该基因,将其克隆到pET-28a(+)载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,裂解菌作SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白前体成功表达,为研究其功能打下了基础.     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

水稻端粒酶RNA候选序列的克隆及特征解析

端粒酶是由端粒酶反转录酶和端粒酶RNA构成,端粒酶RNA中含有端粒合成所需的模板序列.现仅获得了拟南芥的端粒酶RNA序列.为了建立快速有效的富集植物端粒酶的方法并克隆水稻的端粒酶RNA序列,研究中使用不同浓度的PEG6000选择性的沉淀端粒酶萃取液中的杂蛋白.结果表明当PEG6000浓度为4％时,端粒酶活力最高,并可以有效降低核糖体28S rRNA和18S rRNA的干扰.从端粒酶蛋白液中提取RNA,并在其3′端连接接头,在模板区设计上游引物,PCR扩增获得一条292 bp的未知片段,其中含有端粒模板序列5'-AAACCCTAA-3′.将该片段及拟南芥端粒酶RNA的转录调控区进行序列比对分析发现,两者具有类似的转录调控元件.因此,初步判定292bp的目的片段为水稻端粒酶RNA的模板下游序列.     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区（命名为Kago2）,构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

发菜中糖基转移酶基因的克隆及原核表达

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生蓝藻,前期转录组测序发现糖基转移酶基因转录水平较正常上调2.29倍.以发菜基因组为模板克隆糖基转移酶基因,获得长度为1 290bp的核酸序列.通过生物信息学分析表明,通过生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要构成方式为随机卷曲和α螺旋,是亲水性蛋白,酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸磷酸化位点个数分别为2、9、18,蛋白质分子量为47.54kDa,等电点为9.33.正负电荷氨基酸残基数分别为61和51.随后,将该基因插入质粒pET-28a中成功构建重组表达质粒,然后转化至BL21大肠杆菌感受态中进行原核表达.在OD值为0.8时,用1mM IPTG在16℃下诱导表达20h后,获得预期大小重组蛋白(47.54kDa).研究首次成功克隆得到发菜糖基转移酶基因,并构建重组质粒于大肠杆菌中高效表达,实验结果为进一步研究发菜多糖代谢分子调控机制奠定了基础,也为今后糖基转移酶基因工程菌株的构建提供理论依据.     

家蚕一个DDRGK超家族成员的克隆及分析

DDRGK类蛋白是在动物及植物中发现的约有300个氨基酸残基的蛋白家族,含有一个高度保守的DDRGK基序,但功能还未知。在对家蚕幼虫cDNA文库的测序中发现了含有该保守结构域的EST序列,经过电子克隆、RT-PCR,获得该基因完整的cDNA序列,将其命名BmDDRGK(GenBank登录号FJ645927)。然后构建了重组质粒转化到大肠杆菌BL21和Rosetta中诱导表达,但经SDS-PAGE检测未检测到重组蛋白的表达。利用Real-timePCR技术对BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期不同组织的mRNA表达水平进行了鉴定。绝对定量结果显示BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期的各个组织中均有较为明显的表达,在五龄幼虫期,以中肠、马氏管、睾丸表达量较高,在蛹期,以翅原基、睾丸的表达量较高。     

SHP-2酪氨酸磷酸酶C—SH2结构域的表达纯化和NMR研究

SHP-2是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶.将其N末端结构域C-SH2克隆至原核表达载体pGEX-2T中,命名为pGEX-2T-C-SH2.该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中,经GST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后,目的蛋白纯度可达98%.质谱分析表明,目的蛋白相对分子量与理论值基本相同.在最适表达条件下,1 L的M9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH2蛋白,NMR结构和活性位点的分析表明,目的蛋白能正确折叠并呈规则的空间结构.     

马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bp)设计合成了两对引物,通过RT-PCR扩增得到长0.7bp的目的片段.将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVX分离物CP基因序列比较,发现其核苷酸同源性最高可达99%左右,证明此病毒为PVX.构建了含PVXCP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定该融合蛋白GST-XCP的相对分子质量为52000.Westemblot分析结果显示,GST-XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应,表明GST-XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性.制备了GST-XCP抗血清,并利用此抗血清建立了PVX的间接ELISA检测方法,检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片.     

消化系统多种癌变组织中3种蛋白质的表达谱

在口腔、食管和结直肠癌病灶中,TATA序列结合蛋白相关因子1(TATA-box binding protein associated factor 1 like,TAF1L)、stomatin家族蛋白1(stomatin-like protein 1,STOML1)和stomatin家族蛋白2(stomatin-like protein 2,STOML2)存在异常表达．为探究它们在消化系统癌变过程中的作用机理,利用6种消化道肿瘤（食道、胃、结肠、直肠、肝脏和胰腺）及癌旁组织的微陈列芯片,通过多重免疫组织化学染色,比对分析TAF1L、STOML1和STOML2这3种蛋白质在癌与癌旁组织的差异表达及与癌变的关联．结果发现,STOML2在食道、胃、结肠、直肠、肝脏和胰腺这6种消化系统癌组织中均呈显著性高表达(P <0.001),而同一家族成员STOML1则仅在食管癌和肝癌组织中表达明显增高(P <0.005)．另外,除胰腺癌灶外,TAF1L在其余5种消化系统癌组织中也呈现高表达(P <0.005)．同时,TAF1L、STOML1和STOML2这3种蛋白质均与上皮间充质转化的...     

E2弱化双酚A雌激素活性机制

前期研究发现天然雌激素E2可以弱化一种常见雌激素类污染物双酚A的活性,为探讨这一现象的机制,利用人体乳腺癌细胞MCF7,从细胞周期、雌激素受体途径、MAPKs信号途径进行实验．结果表明:E2可诱导DNA合成期细胞显著增高,抑制受体蛋白表达,提高ERK蛋白的表达,进而激活多种转录因子;双酚A显著抑制受体蛋白表达,对MAPKs信号通路基本没有影响,可同时提高DNA分裂期与间歇期细胞比例;两者联合后活化了受体途径和ERK途径,促进Cfos的转录表达,激活cyclin D1蛋白,增加S期及G2期细胞比例．E2弱化双酚A的可能机制为Cmyc蛋白表达下降．     

野生大豆DREB基因的筛选与结合功能分析

以野生大豆(Glycine Soja)为材料,利用酵母单杂交的方法筛选到一个能够与DRE元件(DehydrationResponsive Element)结合转录因子-GsDREB(DRE Binding protein).通过体内和体外结合试验分析,该转录因子能够与DRE元件结合,经序列分析,GsDREB氨基酸序列N-末端含有核定位信号(nuclear localization sig-nal,NLS)、在C-末端含有酸性活性区域(acidic activation region,AAR),在序列内部具有由58个氨基酸编码的、能够与DNA结合的保守区域-DREBP/AP2结构域.该蛋白可能是野生大豆DREB家族的新成员.     

芽孢杆菌BC4铬抗性相关基因chrA的克隆表达

以芽孢杆菌BC4菌株为对象,通过对其铬抗性相关基因chr A的克隆表达来测定其编码蛋白ChrA还原Cr(Ⅵ)的能力以及该蛋白在芽孢杆菌Cr(Ⅵ)去除中的作用,可帮助进一步阐明芽孢杆菌与Cr(Ⅵ)的作用机理,并为芽孢杆菌应用于铬污染治理奠定理论基础。PCR扩增出芽孢杆菌BC4菌株铬抗性相关基因chr A,PCR产物经克隆与测序,得到chr A完整的DNA序列。该序列大小为1182bp,共编码393个氨基酸,预测编码蛋白分子量为43kDa。根据利用NCBI所进行的BLAST序列比对结果,判断该基因为铬转运蛋白编码基因。将chr A基因PCR产物双酶切后连接到表达载体pET28b并转化进大肠杆菌BL21中,对其表达产物进行分析。结果表明,chr A基因在大肠杆菌BL21中表达约43kDa的蛋白,与预期结果相符;重组菌株对Cr(Ⅵ)的耐受能力高于对照菌株,说明ChrA蛋白在芽孢杆菌BC4的Cr(Ⅵ)抗性机制中起重要作用,且重组菌株对Cr(Ⅵ)具备较强的抗性。     

人结直肠癌中两种新分子生物标记物的筛选

为挖掘结直肠癌早期病变的生物标记物,通过对高通量组织芯片上进行优化的多重免疫组织化学染色,观察比对了TATA序列结合蛋白相关因子1 (TATA-box binding protein associated factor 1 like,TAF1L)和stomatin家族蛋白1 (stomatin-like protein 1,STOML1)在结直肠癌组织和相匹配的癌旁正常组织之间的表达差异,检测了其表达水平与癌组织的不同临床分期、病理分级和tumor-lymph node-metastasis(TNM)分期的关系.结果显示,相比癌旁正常组织,TAF1L蛋白质在癌组织中呈高表达,差异具有统计学显著性意义(P 0. 000 1),并可随原位病灶的恶化显现明显的表达改变; STOML1蛋白质的表达水平在癌组织中差异无明显统计学意义(P 0. 05).结果显示,TAF1L蛋白质的异常高表达与结直肠癌的发生发展可能存在直接的关联,有可能成为结直肠癌早期诊断、精准治疗和预后判定的新分子标记物.     

高碳水化合物条件下鼠肌GLUT4表达与CaMK／HDAC5关系的研究

观察Caffeine诱导骨骼肌细胞GLUT4表达的潜在分子调控机制是否是Caffeine—Ca2＋-CaMKII—HDAC5信号通路。8周龄雄性Wistar大鼠42只,随机分为高碳Caffeine组（HGC）、高碳KN62组（HGK）、低碳Caffeine组（LGC）和低碳KN62组（LGK）,每组12只。分别给予不同饮食加Caffeine或KN62刺激。检测caMKⅡ（Thr286）位点、HDAC5（sel498）位点和HDAC5（Ser259）位点磷酸化水平以及GLUT4蛋白表达水平。与HGc组相比LGC组GLUT4蛋白表达、CaMKⅡ（Thr286）、HDAC5（Se-98）HDAC5（Ser259）磷酸化水平都显著增加性高于HGC组和LGK组。无论是在低碳还是在高碳浓度下骨骼肌细胞GLUT4蛋白表达变化都对应着上游caMKⅡ蛋白位点（Thr286）磷酸化水平和下游HDAC5蛋白位点（Ser498）和（Ser259）磷酸化的变化,所以CaMKⅡ调节GLUT4表达的机制至少涉及到CaMKⅡ征用转录抑制子HDAC5。