PD-1抗体表达载体的构建以及其功能的探究

通过构建含PD-1抗体基因的重组腺病毒表达载体Ad35-anti-PD-1,表达的PD-1抗体以探究其对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗肿瘤功能的影响。用ELISA实验检测Ad35-anti-PD-1在293细胞中PD-1抗体的表达量;利用Protein G亲和层析法纯化PD-1抗体;通过体外杀伤实验研究PD-1抗体阻断PD-1信号通路的CTL杀伤肝癌细胞能力的变化。显示成功构建重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1,滴度为1×1010 pfu/mL;ELISA实验检测在72h时293细胞上清中PD-1抗体的表达量约在600ng/mL;Westernblotting实验证明PD-1抗体包含正确的重链（50kD）和轻链（25kD）;ELISA实验检测从100mL细胞上清中得到1mL浓度在40μg/mL的PD-1抗体;体外杀伤实验证明CTL在添加PD-1抗体的环境中杀伤肝癌细胞的能力显著增强。     

二代噬菌体展示淘选PD-1结合肽及其模拟位点分析

阻断PD-1/PD-L1相互作用可以激活肿瘤浸润性T细胞并恢复其抗肿瘤活性,对于恶性肿瘤具有较好的治疗作用。尽管靶向PD-1/PD-L1通路的抗体药物对癌症有一定的疗效,但现有抗体药物存在生产成本高、个体差异大、引发不恰当的免疫反应等问题,而且还伴随着不可避免的缺陷,如器官或肿瘤渗透性差、口服生物利用度差等,因此迫切需要寻求多肽抑制剂等来弥补当前PD-1/PD-L1相互作用抗体阻断剂的缺点。该文以重组人PD-1蛋白为靶标,首次采用二代噬菌体展示技术淘选Ph.D.-7和Ph.D.-12噬菌体展示文库,获得了400条潜在的PD-1结合肽同时基于BLOSUM62打分矩阵对PD-1结合肽数据集进行了聚类分析。最后,对PD-1结合肽数据集进行了氨基酸组成、基于位置的氨基酸偏好性分析以及模拟位点分析。该文获得的PD-1结合肽有望开发成阻断PD-1/PD-L1相互作用的候选多肽药物,研究结果对于PD-1结合肽的计算设计有一定的指导意义。     

携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

携带全长抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b—Anti—CD20载体构建与表达研究

构建Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒载体并探索该腺病毒在体外表达全长抗体的能力.合成部核糖体进入位点(IRES)序列,将其与美罗华抗体重轻链连接,克隆到pDC338质粒载体上,并与以11b型腺病毒(Ad11b)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒骨架质粒pAd5F11b进行重组,获得Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒.将鉴定正确的病毒空斑感染293细胞,ELISA检测其表达水平以及间接免疫荧光检测该病毒表达抗体的特异性.结果表明,嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20在293细胞中的表达量高达3.78 μg/ml±0.30 μg/ml,间接免疫荧光(IFA)显示该病毒表达的抗体只与CD20+的Raji细胞有特异性结合,而与CD20-的Molt-4细胞无结合能力.成功构建了高效表达抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20.     

GLP-1受体siRNA表达载体的构建

为了考察胰高血糖素样肽1受体在神经保护过程中的作用,设计并构建了胰高血糖素样肽1受体的干扰质粒,通过转染PCI2细胞,对其干扰效率进行了分析,获得了对glp—lr基因有较好干扰效率的siRNA质粒,为今后研究GLP一1受体的功能提供了实验材料．     

鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

研究以AFB1-BSA免疫的小鼠脾脏细胞为试验材料,利用RT-PCR技术,克隆了抗AFB1抗体重链和轻链可变区基因VH和VL,利用连接肽（Gly4Ser）3将VH和VL链接成单链抗体基因scFv,通过噬菌体展示载体pCANTAB-5E携带将其电转化E.coli TG1,经氨苄青霉素平板筛选,构建了库容为2.13×10^9 cfu/μg DNA的噬菌体单链抗体库,抗体库的克隆阳性率达到100%,且多样性良好,为高活性抗AFB1单链抗体的筛选提供了材料基础。     

LC-1 ScFv偶联GFP基因的构建及表达

从具有高效蛋白表达及活力的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株（LC-1）抽提总RNA，反转录成cDNA。根据肿瘤单链抗体（ScFv）基因设计引物，用多聚酶链式反应（PCR）克隆出抗体的重链和轻链基因，并通过重叠延伸PCR法将重链基因与修饰后的轻链基因连接为单链抗体基因。改造后的ScFv与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建表达质粒ProGFP-ScFv，随后转化大肠杆菌JM109，用诱导剂IPTG进行诱导表达。表达产物采用Ni-NTA树脂进行纯化，进行SDS-PAGE电泳分析其纯度。酶联免疫检测（ELISA）表明该蛋白已具有抗体活性。395 nm激光激发显示绿色荧光，表明目的基因在原核生物中存在表达。     

人参3-O-UGT1基因RNAi表达载体工程菌的构建

人参3-O-UGT1基因(Pg3-O-UGT1)是控制人参中二醇型单体皂苷合成的关键酶基因,而二醇型皂苷和三醇型皂苷具有相反的药理活性。本文利用RT-PCR技术和酶切连接技术成功构建人参3-O-UGT1基因RNAi(RNA interference)植物表达载体,通过热转化法将重组表达载体转化进发根农杆菌A4中,得到含有人参3-O-UGT1基因RNAi植物表达载体的工程菌,为诱导人参外植体转化和人参皂苷合成机理奠定了基础。     

小鼠sox2基因的克隆及其原核表达载体构建

TAT穿膜肽能携带大分子物质进入细胞。NLS核定位信号肽是能帮助亲核蛋白进入细胞核的短肽。SoxB1家族的SOX2是维持ES细胞全能性的重要转录因子。通过RT-PCR方法从小鼠胚胎干细胞中克隆得到小鼠sox2基因,将其与穿膜肽基因tat和核定位信号基因nls融合,利用原核表达载体进行融合蛋白表达,并将表达的蛋白纯化、复性得到复性蛋白,为今后对SOX2蛋白的功能及生物学活性展开研究奠定了基础。     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

抗大肠杆菌荧光抗体的制备及其特性

活体大肠杆菌与弗氏不完全佐剂乳化后注射到新西兰大白兔体内15d后,利用两步沉淀法提取并纯化得到大肠杆菌表面蛋白抗体IgG,与FITC的交联率F/P达到2.7,未发现FITC对大肠杆菌表面蛋白抗体的特异性有显著的影响。将抗大肠杆菌荧光抗体注入小白鼠体内后,除肠道内有荧光显示外,肝脏、心脏、肾脏中未发现荧光显示,表明大肠杆菌只在小白鼠大肠存在,根据观测到的荧光强度可定性和定量地判断大肠中的大肠杆菌。     

人源性rhG-CSF单链抗体基因的克隆和表达

从构建的噬菌体表面展示文库中，筛选出全新的人源抗重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）特异单链抗体（ScFv）的噬菌体克隆。ScFv被克隆到pCANTAB 5E载体上，以E. coli TG1为宿主，进行噬菌体表面呈现，以rhG-CSF为靶抗原进行免疫亲和富集筛选，经酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定，得到一株高亲和力克隆。DNA序列分析表明，该ScFv基因全长733 bp，其中重链可变区（VH）为366 bp，轻链可变区（VL）为322 bp。抗rhG-CSF的ScFv在E. coli HB2151中以可溶形式分泌表达，产物主要分布于周质中，占周质总蛋白的质量分数为20%～25%，经免疫印迹试验（Western-blot）分析显示该单链抗体黏均分子量为31 kD。     

GLP-1毕赤酵母表达载体的构建及重组菌株的筛选

选择了一种人胰高血糖素样肽(GLP)-1作为研究对象,全基因合成GLP-1基因序列,用限制性内切酶Xba I和Xho I双酶切合成后的pUC57质粒获得目的基因。以XbaI和XhoI双酶切表达质粒pPICZαA,将目的基因与表达质粒pPICZαA用T4连接酶连接,构建pPICZαA-GLP-1质粒,转入毕赤酵母GS115。合成的目的基因序列为128bp,用GLP-1特异性引物扩增阳性重组子,得到120bp左右的片段。将此特异性片段扩增回收,测序发现确为GLP-1基因,表明成功转入毕赤酵母中。为进一步研究GLP-1在毕赤酵母中的高效表达奠定了坚实的基础。     

条纹斑竹鲨的抗乙肝表面抗原的单域抗体筛选与重组抗体活性探究

对免疫HBsAg-ad亚型抗原的条纹斑竹鲨中血清、脾脏和淋巴细胞进行多组学测序结果综合分析筛选出特异性序列,构建重组表达质粒 pET-Duet-his-sumo-Anti-HBsAg-S1、pET-Duet-his-sumo-Anti-HBsAg-S2,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),并诱导表达以及纯化重组单域抗体...     

sCAR-PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白(PPA)的亚基B(PPAb)的融合蛋白,将PPAb基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42 kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad-EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

人p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

构建了人p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）cDNA序列的绿色荧光真核表达载体,并鉴定其在人胚肾293（human embryo kidney293,HEK293）细胞中的表达．采用PCR方法从含人p75NTR的pDC316-HP75质粒中扩增目的片段,经EcoRI和SalI双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达载体pEGFP-N1-HP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及Western blot法鉴定人p75NTR的表达．结果表明,酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有人p75NTR编码序列,转染实验表明,重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的人p75NTR片段．     

人参β-AS基因RNAi表达载体工程菌的构建

利用重组PCR和酶切连接技术构建了人参β-香树素合成酶(β-AS)基因RNAi(RNAinterference,RNAi)植物表达载体,再经热转化法转化到发根农杆菌A4菌株中,得到含有人参β-AS基因RNAi植物表达载体的工程菌,为诱导转化人参外植体奠定了基础。     

海参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及活性鉴定

采用原核宿主大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了具有活性的仿刺参铜锌超氧化物歧化酶(Apostichopus japonicus Cu/Zn-superoxide dismutase,Aj-SOD1)蛋白。利用Trizol法从海参肠组织中提取总RNA,通过反转录PCR扩增获得Aj-SOD1基因的编码序列(GenBank:JX097096.1,459bp),构建克隆载体pMD18-Aj-SOD1;在目的基因两端引入(XhoⅠ/NdeⅠ)酶切位点,构建克隆载体pMD18-AjSOD1(XhoⅠ/NdeⅠ)。将此载体与表达质粒pET30a(+)分别双酶切后连接,构建重组表达载体pET30a-Aj-SOD1。转化至大肠杆菌BL21(DE3),Kan+抗性筛选阳性转化子,获得基因工程菌BL21(DE3)-pET30a-Aj-SOD1。SDS-PAGE和邻苯三酚自氧化法检测发现,经0.1 mmol/L IPTG诱导8h后,成功获得具有抗氧化活性的Aj-SOD1蛋白。     

抗氨甲酰化蛋白抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

为了制备抗氨甲酰化蛋白抗体,探讨了氨甲酰化与瓜氨酸化之间的关系,开发氨甲酰化蛋白检测试剂盒。以牛血清白蛋白(BSA)和氰酸钾(KCNO)为原料合成人工完全抗原(Hcit-BSA),然后免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,获得抗血清,间接ELISA测定抗体效价,用方阵实验确定抗体最佳稀释倍数和包被抗原的最佳包被浓度,间接竞争ELISA检测抗体特异性。结果表明:抗体效价大于1∶8 000,抗体最佳稀释倍数为1∶4 000,包被原最佳包被浓度为0.25μg/mL,抗体能特异性识别氨甲酰化产物(carbamylation-derived products,CDPs)。Hcit-BSA具有较强免疫原性,使BALB/c小鼠产生抗氨甲酰化蛋白抗体,也为建立一种简便、快速、特异性强的免疫分析方法奠定了基础,为一些疾病的早期快速检测提供了可能。     

HBV/HEV二价抗原的载体构建与表达

为构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价疫苗抗原的大肠杆菌高效重组原核表达载体,采用PCR方法扩增出HBV的S基因,及HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,经过T载体连接、菌落PCR、双酶切、测序鉴定后,将这两部分重组入含有增强子的pT-T7高效的E.coli表达载体中。构建了pT-T7SE表达载体并且表达出相应的目的蛋白。该实验结果为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。