家蚕表达重组人乳铁蛋白及产物对溃疡性结肠炎的治疗作用

乳铁蛋白（LF）在抗炎和参与机体免疫调节方面具有重要作用。利用家蚕杆状病毒表达系统构建含人乳铁蛋白（hLF）基因的重组病毒Bm-hLF,接种蚕蛹表达重组人乳铁蛋白（rhLF）,ELISA法检测rhLF的表达量,体外抑菌试验检测其抑菌活性,并建立小鼠溃疡性结肠炎（UC）模型,探究口服rhLF蚕蛹粉对UC的治疗效果。结果表明：rhLF在蚕蛹感染重组病毒120h后表达量最高达0.38mg/mL蚕蛹匀浆上清液;rhLF蚕蛹粉能抑制E.coli TG1的生长;口服rhLF蚕蛹粉可明显降低UC小鼠的疾病活动指数（DAI）、髓过氧化物酶（MPO）含量,减轻结肠组织炎症损伤,为今后开发一种新型、廉价的UC口服药物提供药效学实验参考。     

人溶菌酶/乳铁蛋白双基因重组质粒在牛乳腺细胞中的表达

研究检测人溶菌酶/乳铁蛋白双基因重组质粒pEBH-IL在牛乳腺上皮细胞中的表达。采用脂质体转染技术,将pEBH-IL质粒DNA导入体外培养的牛乳腺上皮细胞中。加入G418对转染的细胞加压筛选,获得稳定转染的细胞。采用绿色荧光蛋白(EGFP)和PCR方法检测牛乳腺细胞基因组中的目的基因,并采用Westhorn Blot对重组质粒在牛乳腺细胞表达产物进行检测。试验表明:G418筛选获得稳定转染的细胞,对照组加压后第7 d细胞全部死亡,转染组第12~15 d汇片达80%左右;在荧光显微镜下观察到EGFP表达;PCR检测到目的基因;阳性细胞培养液中检测到目的蛋白的表达。结果表明:以人溶菌酶/乳铁蛋白为目的基因构建的重组质粒pEBH-IL在牛乳腺细胞中具有表达功能。     

家蚕表达人促红细胞生成素口服急性毒性和初步药效学研究

为了研究家蚕表达的重组人促红细胞生成素(BmrhEPO)口服治疗肾性贫血的疗效并评价安全性,进行了小鼠口服BmrhEPO急性毒性实验,结果显示其对小鼠基本无毒或毒性极低,小鼠口服BmrhEPO最大耐受剂量大于147 882IU/kg。肾性贫血小鼠以剂量为62 865IU/kg和20 955IU/kg的两个剂量组连续口服BmrhEPO一周,以小鼠血液网织红细胞数及百分率为药效指标,结果显示口服有药效,并且药效与剂量呈正相关。本实验为开发重组人促红细胞生成素口服药物提供了理论指导和实验基础。     

携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

非洲猪瘟病毒P30蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化重组非洲猪瘟病毒P30蛋白,并进一步制备抗P30重组蛋白的多克隆抗体,为非洲猪瘟病毒诊断试剂盒的研发提供实验材料和理论依据。根据GenBank中非洲猪瘟结构蛋白P30序列,经密码子优化后合成相应的基因序列,构建重组表达质粒pET-32a-P30并转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达纯化后获得重组P30蛋白,并制备抗P30的多克隆抗体。结果表明:16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达12 h获得质量浓度为0.6 mg/mL以上的重组P30蛋白,Western blot证实原核表达的P30具有较好的免疫原性,ELISA检测纯化后的多克隆抗体效价高达1∶5120000,且具有良好的抗原特异性。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确。电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15ku一致,其表达量占分泌总蛋白的32%。体外抑菌实验证实重组人溶菌酶蛋白对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌均有明显的抑菌作用,表明在毕赤酵母中成功表达了重组人溶菌酶。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

家蚕表达人促红细胞生成素口服急性毒性和初步药效学研究

为了研究家蚕表达的重组人促红细胞生成素（BmrhEPO）口服治疗肾性贫血的疗效并评价安全性,进行了小鼠口服BmrhEPO急性毒性实验,结果显示其对小鼠基本无毒或毒性极低,小鼠口服BmrhEPO最大耐受剂量大于147 882IU/kg。肾性贫血小鼠以剂量为62 865IU/kg和20 955IU/kg的两个剂量组连续口服BmrhEPO一周,以小鼠血液网织红细胞数及百分率为药效指标,结果显示口服有药效,并且药效与剂量呈正相关。本实验为开发重组人促红细胞生成素口服药物提供了理论指导和实验基础。     

新型结肠癌个性化治疗重组溶瘤腺病毒Ad—CEA-ZD55-ST13的构建

一种新型的重组溶瘤腺病毒Ad-CEA-ZD55-ST13被成功构建.该病毒利用CEA(carcinoembryonic antigen)启动子和ST13基因特异性增强ZD55系统的肿瘤靶向性.实验表明,重组溶瘤腺病毒Ad-CEA-ZD55-ST13能在结肠癌细胞株SW620中增殖;Ad-CEA-ZD55-ST13增加ST13基因在HCT116细胞中的表达量;Ad-CEA-ZD55-ST13比对照病毒Ad-CEA-ZD55-EGFP对HCT116的杀伤作用强.     

增殖腺病毒SG600-IL24与非增殖腺病毒Ad-IL24的抗肿瘤效果比较

利用DNA克隆和重组技术,构建增殖腺病毒SG600-IL24.ELISA检测比较SG600-IL24和非增殖腺病毒Ad-IL24分别感染肝癌细胞BEL-7402、Hep3B、HepGⅡ、SK-Hep-1和成纤维细胞BJ细胞后IL24的表达量,表明SG600-IL24病毒能在肿瘤细胞内大量表达IL-24,最高可达773 ng/mL(MOI=1),且在多数肿瘤细胞内IL24表达量显著高于Ad-IL24,而在正常细胞内表达量与Ad-IL24基本相同.半数组织感染剂量(TCID50)法检测SG600-IL24 48 h和96 h的增殖情况,发现SG600-IL24可在上述4种肿瘤细胞内大量增殖,96 h的最高增殖倍数可达到246153.MTT法和CPE法对比SG600-IL24和Ad IL24对不同细胞的杀伤作用结果显示上述4种肿瘤细胞SG600-IL24对上述4种肿瘤细胞的50%杀伤剂量(IC50)和90%杀伤剂量(IC90)均明显低于Ad-IL24.以上结果表明SG600-IL24体现了病毒治疗与基因治疗的双重抗肿瘤用,其效果明显好于Ad-IL24,为该病毒治疗肝癌的体内研究打下基础.     

家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV的RBD蛋白及其免疫原性研究

利用杆状病毒表面展示技术,构建展示SARS-CoV的棘突蛋白(spike protein)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的重组杆状病毒vBmgp64-RBD,并进一步研究其展示目的蛋白的免疫原性。结果表明:RBD蛋白正确表达并成功展示在病毒囊膜表面,将灭活的纯重组杆状病毒vBmgp64-RBD皮下注射BALB/c小鼠能产生抗RBD蛋白的特异性抗体,且抗体具有抗RBD蛋白的中和作用。证明vBmgp64-RBD有可能作为一种基于杆状病毒的新型SARS疫苗,为SARS的体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础。     

植物乳杆菌HS-R9培养基的优化

以培养乳酸菌的传统培养基MRS为基础,利用单因素试验和响应面法对植物乳杆基主要成分进行优化.最优培养基选择碳源为19.48 g/L的乳糖,氮源为21.12 g/L的酵母浸粉,缓冲溶剂为2.92 g/L的柠檬酸铵.与MRS培养基相比,在优化培养基下发酵上清液抑菌活性提高了20.29％.抑菌活性检测发现,植物乳杆菌HS-R...     

携带全长抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b—Anti—CD20载体构建与表达研究

构建Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒载体并探索该腺病毒在体外表达全长抗体的能力.合成部核糖体进入位点(IRES)序列,将其与美罗华抗体重轻链连接,克隆到pDC338质粒载体上,并与以11b型腺病毒(Ad11b)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒骨架质粒pAd5F11b进行重组,获得Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒.将鉴定正确的病毒空斑感染293细胞,ELISA检测其表达水平以及间接免疫荧光检测该病毒表达抗体的特异性.结果表明,嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20在293细胞中的表达量高达3.78 μg/ml±0.30 μg/ml,间接免疫荧光(IFA)显示该病毒表达的抗体只与CD20+的Raji细胞有特异性结合,而与CD20-的Molt-4细胞无结合能力.成功构建了高效表达抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20.     

家蚕天然Hemolin蛋白原核表达

Hemolin蛋白是一种类免疫球蛋白,属于昆虫的一种重要的先天性免疫球蛋白,家蚕(Bombyx mori)Hemolin蛋白与其他昆虫的序列具有高度的同源性,为了进一步分析家蚕Hemolin蛋白的功能,以杆状病毒感染的家蚕蚕蛹为原料,通过抗体亲和层析获得高纯度的天然Hemolin蛋白。结果表明:重组表达菌株pET-32a-hemolin经终浓度为0.1 mmol/L IPTG低温诱导后可在大肠杆菌BL21中成功表达;通过镍离子金属螯合亲和层析并经200 mmol/L咪唑洗脱可以获得较纯的重组Hemolin蛋白;免疫新西兰大白兔产生特异性多克隆抗体通过蛋白A亲和层析柱纯化后可获得高纯度的Hemolin抗体,并经抗体亲和层析获得的天然Hemolin蛋白纯度高,可用于对Hemolin蛋白功能的进一步研究。文章提供的分离纯化高纯度家蚕天然Hemolin蛋白的方法能够推进天然免疫蛋白的纯化,为进一步研究家蚕天然Hemolin蛋白的晶体结构、蛋白质抑菌功能以及抗病毒活性奠定基础。     

携带11R穿膜肽-p53融合蛋白基因的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用

p53是研究较为广泛的抑癌基因,可通过不同的途径来抑制或杀伤肿瘤细胞.为增强p53的抗瘤活性,将穿膜肽11R与p53的融合蛋白基因插入增殖型腺病毒载体中,在293细胞中经同源重组筛选获得重组溶瘤病毒SG7605-11R-p53;利用Western blot检测11R-p53的表达情况,TCID50方法测定病毒滴度;应用细胞活力检测实验(MTT)比较病毒杀伤肿瘤及正常细胞的效果.结果显示:SG7605-11R-p53所携带的11R-p53基因在所选细胞株中都能正确表达,与SG7605-p53、AD5-p53相比具有更好的杀伤肿瘤细胞的效果,显示了较强的抗肿瘤效应.说明SG7605-11R-p53是一种有潜力的治疗肿瘤的新型基因-病毒治疗系统.     

重组精氨酸脱亚胺酶的制备工艺

研究了重组精氨酸脱亚胺酶(r ADIES)的30 L规模发酵、制备工艺及其生物学活性。将构建好的工程菌先进行摇瓶活化获得种子液,转入30 L发酵罐进行培养,用IPTG进行诱导表达;表达产物进行高压匀浆破菌、包涵体洗涤、溶解稀释复性后经DEAE阴离子交换层析柱和Butyl疏水层析柱纯化;通过SDS-PAGE和RP-HPLC等方法检测表达和纯度;用体外测活法检测活性。将工程菌进行放大培养并诱导表达,获得了相对分子质量在46 k Da的r ADIES。重组蛋白表达量占总蛋白的25%以上,经制备工艺获得的r ADIES纯度高于95%,酶活性为42IU。实验结果表明:该工艺具有可行性,可以获得较高活性的重组精氨酸脱亚胺酶。     

利用SUMO技术表达可溶性的拟南芥AtRD22蛋白

为了体外获得可溶性的拟南芥AtRD22蛋白,以拟南芥叶片提取的总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)为模版,反转录获得AtRD22的全长互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,c DNA),分别构建AtRD22的原核重组表达载体p ET32a-RD22和p SUMO-RD22,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行AtRD22蛋白的表达.在0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dithiogalactopyranoside,IPTG)诱导下,探索不同培养温度和诱导时间对可溶性蛋白表达的影响.结果表明,在实验条件下,转化p ET32a-RD22的重组菌表达AtRD22蛋白的总量高于转化p SUMO-RD22的重组菌,但后者的可溶性AtRD22蛋白表达量明显高于前者.当诱导温度为28或16℃,时间分别为6.0或8.0 h以上时,转化p SUMO-RD22的重组菌中可溶性目的蛋白的表达量相对较大.为进一步在体外研究AtRD22蛋白质的结构和功能奠定了基础.     

携带oct4、klf4s、ox2、nanog4种转录因子的腺病毒载体的构建

构建并鉴定携带人oct4、klf4、sox2、nanog4个基因的腺病毒载体,重组出能同时表达这4种转录因子的腺病毒,为进一步诱导多能干细胞的研究提供新方法。使用口蹄疫病毒2A序列将人的oct4、klf4、sox2、nanog4个基因顺序连接,定向克隆至腺病毒载体pDC328上,并在nanog下游插入红色荧光蛋白dsRed2作为报告基因。利用酶切及PCR方法鉴定病毒载体的正确性;荧光显微镜下观察病毒感染HEK 293细胞24 h后红色荧光的表达,检测病毒功能;实时定量PCR检测细胞内4种基因的表达情况。结果表明,酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组后病毒PCR显示病毒携带oct4、klf4、sox2、nanog基因;荧光显微镜下观测到红色荧光的表达,实时定量PCR检测到细胞内4种基因的表达。本研究成功构建的腺病毒载体,能够介导以上4种转录因子在细胞内的同时表达,为进一步诱导多能干细胞的提供新方法。     

红色荧光蛋白标记的小鼠胚胎干细胞系建立及体内成瘤的初步研究

建立能够稳定表达红色荧光的小鼠胚胎干细胞系,并研究其在体内不同部位形成畸胎瘤的能力。构建含红色荧光蛋白(DsRed-Express)的表达质粒,并采用磷酸钙法包装成慢病毒转染小鼠胚胎干细胞(mESCs)。筛选得到强阳性克隆,对其进行RT-PCR检测和裸鼠、C57小鼠体内成瘤实验验证细胞特性,最后获得稳定表达红色荧光的胚胎干细胞(Red-ESCs)。Red-ESCs能够表达多能性基因,如Oct4,Sox2,Nanog等,也能在裸鼠体内成瘤。不同部位的畸胎瘤在基因表达上有差异,其中肝部形成的畸胎瘤表达肝特性基因。成功建立稳定表达红色荧光的小鼠胚胎干细胞系,其在体内形成的畸胎瘤性质受到体内环境的影响。