Pichia酵母表达重组人可溶性TRAIL的纯化与生物活性

目的分离纯化Pichia酵母表达的重组人可溶性TRAIL,并检测其生物活性。方法以Pichia酵母分泌型表达TRAIL,采用硫酸铵沉淀和柱层析纯化可溶性TRAIL蛋白。以SDSPAGE、ESIMS和Westernblot法鉴定其纯度及特异性。以细胞透射电镜、DNALadder和MTT法检测其诱导肿瘤细胞凋亡活性。结果目的蛋白以可溶形式存在,蛋白相对分子质量22000,纯化后纯度95%。Westernblot证实为TRAIL蛋白。电镜、DNALadder和MTT均证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论Pichia酵母表达rhsTRAIL可用柱层析法纯化,并具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性。     

氧在重组毕氏酵母发酵过程中的摄取与传递

引言 在生物发酵过程中,氧的供需是一个至关重要的问题[1-2].好气性微生物需要足够的溶解氧以维持自身的呼吸代谢.     

用毕氏酵母表达蛇岛蝮蛇毒类凝血酶发酵条件的优化

为了提高大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶的表达量 ,利用 5 0 0ml摇瓶培养体系研究了在不同培养基、pH值、发酵时间等培养条件下分泌蛋白的浓度及活性 ,使发酵条件得到优化 :丰富培养基比营养缺陷型培养基更利于目的蛋白的分泌表达 ,发酵优惠条件 pH值为 6 0 ,时间为 36h ,发酵液上清能检测到靶酶的酰胺水解活性。类凝血酶的表达量约为 4mg/L。     

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体质控方法与质量标准的建立

目的建立重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的质控方法和质量标准。方法利用乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制试验测定重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的生物学活性;RP-HPLC和SECHPLC测定其纯度;胰酶酶切,HPLC测定其肽图;荧光定量PCR检测E.coli宿主DNA残留量;ELISA法测定宿主蛋白残留量;Edman降解法进行N-末端序列测定;水平等电聚焦电泳法测定等电点;其余检测项目按《中国药典》三部(2010版)规定进行。同时对通常在原液中进行检定的宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定进行初步的方法验证,考察其在成品中进行检测的可行性。结果经初步验证,在成品中进行宿主DNA残留、菌体蛋白残留、N-末端序列测定具有可行性,用建立的方法对重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。同时只对成品进行质控的方法和质量标准对同类产品的质量控制具有借鉴意义。     

重组hTRAIL腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达hTRAIL基因的重组腺病毒载体。方法以重组质粒pThioHisA-TRAIL中提取的TRAIL基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α。筛选重组质粒pShuttle-CMV-TRAIL,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-TRAIL,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长TRAIL基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)。氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-TRAIL病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测TRAIL基因在293细胞中的转录。以Ad-TRAIL转染YTMLC细胞,采用免疫荧光法和流式细胞术检测TRAIL基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒颗粒数为2.77×1012VP/ml,感染性滴度为109.5(3.2×109)CCID50/ml。经RT-PCR扩增出约843bp的基因片段,与目的片段大小一致。流式细胞术和免疫荧光法均检测到TRAIL在YTMLC细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论已成功构建了表达hTRAIL重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。     

重组2型腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因治疗制剂的质量分析

目的对重组2型腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(recombinant adeno-associated virus 2 encoding tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand,r AAV2-TRAIL)基因治疗制剂进行质量分析,并针对其关键质量属性建立质控方法。方法采用PCR法对r AAV2-TRAIL基因治疗制剂中插入的启动子CAG和目的基因TRAIL进行鉴别;在腺病毒(Ad5)的辅助下,将r AAV2-TRAIL体外感染293T细胞后,采用ELISA法检测培养上清中目的蛋白TRAIL的表达量,检测r AAV2-TRAIL对神经胶质瘤U251细胞的体外杀伤活性;设计引物及探针,采用Q-PCR法检测r AAV2-TRAIL基因治疗制剂中的r AAV2-TRAIL滴度、可能存在的复制型rc AAV滴度以及残余辅助病毒1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV1)滴度。结果启动子CAG和目的基因TRAIL的PCR鉴定结果与理论及理化对照品相符;r AAV2-TRAIL感染293T细胞48 h后,上清中TRAIL表达量为(0.36±0.18)ng/ml,RSD为50.0%;r AAV2-TRAIL体外作用于神经胶质瘤细胞U251,细胞生长相对抑制率为(26.6±3.75)%,RSD为14.1%;制剂中r AAV2-TRAIL滴度为(4.72×1011±0.52×1011)copies/ml,RSD为11.0%,rc AAV滴度为(2.49×107±0.18×107)copies/ml,RSD为7.2%,HSV1滴度为(6.02×106±0.51×106)copies/ml,RSD为8.5%。r AAV2-TRAIL/rc AAV为1.90×104,r AAV2-TRAIL/HSV1为7.84×104。结论建立的质控方法可用于r AAV2-TRAIL的质量控制,为该产品质量标准的建立奠定了基础,同时对以AAV为载体的基因治疗制剂的质量研究提供参考。     

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在E.coil中的表达、纯化及其生物学活性

目的表达纯化可溶性肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosisinducing ligand,TRAIL)蛋白,并测定其生物学活性。方法利用E.coli中表达C-端带有6×His标签的可溶性TRAIL蛋白,并优化诱导时间(4、6和8 h)和诱导剂IPTG的浓度(0.06、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L)。表达产物经Ni亲和层析和离子交换层析纯化后,采用MTT法测定不同浓度TRAIL(终浓度分别为100、200、400 ng/ml)的活性,并检测亲和层析过程中两种洗脱方式(洗脱液4℃留柱过夜后进行洗脱和洗脱液进柱后直接收集流出液)及纯化过程中两次透析的时间(均为24和48 h)对TRAIL活性的影响。结果最佳诱导时间为6 h,最佳IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L。表达产物的表达量占菌体总蛋白的20%,相对分子质量为20 000,可与兔抗人TRAIL单克隆抗体发生特异性结合。TRAIL终浓度为100、200和400 ng/ml的实验组的抑制率分别约为36%、53%和73%。亲和层析的两种洗脱方式的TRAIL活性差异无统计学意义(P0.05),透析48 h比透析24 h获得的TRAIL活性显著降低(P0.05)。结论 TRAIL蛋白成功在E.coli中表达,具有抑制肿瘤细胞生长的作用,优化后的TRAIL诱导条件和纯化方法可进一步大量生产高TRAIL蛋白的活性,满足了TRAIL的基础及临床相关研究的要求。     

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化

目的克隆碱性纤维素酶基因,构建酵母整合型表达质粒,在巴氏毕赤酵母中表达,并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因,克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833,并转化至巴氏毕赤酵母GS115。通过单因素实验及正交实验,确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵,观察碳源对批式发酵的影响,并检测在4种流加方式(连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加)下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确,其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6%葡萄糖、2%硫酸铵、12g/L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS-PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重(29.8g/L)及酶活力(24U/ml)。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌,并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

不同发酵时间对酵母发酵的影响

将酵母菌进行36、72、108h液体发酵后,检测其发酵液中残糖量、酒精含量、总酸和氨基酸态氮含量变化情况,为酵母菌液体发酵最佳时间提供科学依据。结果表明:酵母发酵36、72、108h后,发酵液中残糖量分别为:18.75、10.37、5.42g/L;酒精含量分别为:酒精度分别为2.07%、4.62%、7.93%;产总酸分别为:3.17、5.14、5.11g/L;氨基酸态氮分别为0.46、0.87、0.85g/L。结论:酵母发酵液中各指标含量会随着发酵时间的变化而变化,由此可知酵母菌在不同发酵时间产生的代谢产物量不同。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及发酵条件的优化

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,并对发酵条件进行优化。方法将人工合成的hLY成熟肽基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/hly,经甲醇低温诱导表达后,取发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测,并对培养基初始pH值、甲醇添加量、诱导温度和时间进行优化。结果人工合成的hly测序结果与GenBank中报道的核酸序列完全一致;GS115/hly经PCR鉴定,hly基因已整合入GS115基因组内;经甲醇诱导表达的GS115/hly发酵液上清具有溶菌活性,活性达30U/ml;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约15200处可见目的蛋白条带;GS115/hly的最佳诱导条件为:培养基初始pH5.0,甲醇添加量2.0%,26℃诱导108h。结论在毕赤酵母GS115中表达了具有较高酶活性的hLY,并对发酵条件进行了初步优化。     

MTS染色法测定重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的生物学活性

目的 建立稳定可靠的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Recombinant human TNF-related apoptosis-induc-ing ligand,rhTRAIL)生物学活性检测方法——MTS染色法。方法采用人非小细胞肺癌细胞(NCI-H460)凋亡-MTS染色法对3批rhTRAIL供试品进行检测,采用四参数回归法计算供试品效价;并对该方法的专属性、精密性和准确性进行验证。结果 3批供试品(20071101、20071102、20071103)的效价分别为7.3×104、8.1×104和9.3×104 U/ml,相关系数(R2)分别为0.998、0.996和0.998。rhTRAIL抗体能完全阻断rhTRAIL与NCI-H460细胞间的应答反应。该方法专属性较好,不同检测板间、不同加样位置、不同工作日间和不同试验人员间检测结果的平均变异系数分别为12%、26%、24%和7%,平均加样回收率为114%。结论 MTS染色法测定rhTRAIL的生物学活性具有较高的准确性和可信度,适用于rhTRAIL生物学活性的常规检测。     

Optimisation of Recombinant Myrosinase Production in Pichia pastoris

Myrosinase is a plant defence enzyme catalysing the hydrolysis of glucosinolates, a group of plant secondary metabolites, to a range of volatile compounds. One of the products, isothiocyanates, proved to have neuroprotective and chemo-preventive properties, making myrosinase a pharmaceutically interesting enzyme. In this work, extracellular expression of TGG1 myrosinase from Arabidopsis thaliana in the Pichia pastoris KM71H (Mut^S) strain was upscaled to a 3 L laboratory fermenter for the first time. Fermentation conditions (temperature and pH) were optimised, which resulted in a threefold increase in myrosinase productivity compared to unoptimised fermentation conditions. Dry cell weight increased 1.5-fold, reaching 100.5 g/L without additional glycerol feeding. Overall, a specific productivity of 4.1 U/L_medium/h was achieved, which was 102.5-fold higher compared to flask cultivations.     

重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解

目的　研究重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解。方法　通过质谱和氨基酸序列分析确定水蛭素的 4种活性异构体 ,再用HPLC监测发酵过程中水蛭素的降解情况。结果　发酵过程中产生了 4种具有较高比活的水蛭素异构体 ,它们分别是目的产物水蛭素Hir6 5及Hir6 5的C 末端降解 1～ 3个氨基酸的产物。发酵时细胞干重达到 16 2g/L ,水蛭素的总活性一直在增加 ,最高为 2 .4 5× 10 4ATU/ml,相当于总产量1.8g/L。但Hir6 5在 4种水蛭素异构体总量中的比例一直在下降。Hir6 5的产量先升高再降低 ,最高为 2 80mg/L。结论　毕赤酵母发酵过程中水蛭素存在降解 ,Hir6 5降解产生了Hir6 2和Hir6 3。     

人碱性成纤维细胞生长因子在植物毛状根和毕赤酵母中的表达

目的在植物毛状根和毕赤酵母中表达人碱性成纤维细胞生长因子(Human basic fibroblast growth factor,hbFGF),并对发酵条件进行优化。方法将hbFGF基因分别克隆至表达载体pCAMBIA1301和pPICZα上,构建重组表达质粒pCAMBIA1301-hbFGF和pPICZα-hbFGF。通过发根农杆菌介导,将pCAMBIA1301-hbFGF质粒转入大豆毛状根;采用电转化法将质粒pPICZα-hbFGF转入毕赤酵母X-33菌株,PCR法筛选阳性转化子,诱导表达。筛选高效稳定表达株,发酵培养并优化发酵条件,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并进行纯化。结果经酶切及测序证明两个重组表达质粒构建正确;经PCR鉴定证明hbFGF基因已整合入大豆毛状根及毕赤酵母基因组中;筛选出了在两种体系中发酵培养的最佳条件;hbFGF在大豆毛状根和毕赤酵母中的表达量分别占总蛋白的31%和42%,且均具有良好的反应原性;经纯化后,均可见相对分子质量约18000的单一条带。结论 hbFGF能够在大豆毛状根和毕赤酵母中高效表达,为其大规模工业化生产奠定了实验基础。     

Improved Production of Recombinant Myrosinase in Pichia pastoris

The effect of the deletion of a 57 bp native signal sequence, which transports the nascent protein through the endoplasmic reticulum membrane in plants, on improved AtTGG1 plant myrosinase production in Pichia pastoris was studied. Myrosinase was extracellularly produced in a 3-liter laboratory fermenter using α-mating factor as the secretion signal. After the deletion of the native signal sequence, both the specific productivity (164.8 U/L/h) and volumetric activity (27 U/mL) increased more than 40-fold compared to the expression of myrosinase containing its native signal sequence in combination with α-mating factor. The deletion of the native signal sequence resulted in slight changes in myrosinase properties: the optimum pH shifted from 6.5 to 7.0 and the maximal activating concentration of ascorbic acid increased from 1 mM to 1.5 mM. Kinetic parameters toward sinigrin were determined: 0.249 mM (K_m) and 435.7 U/mg (V_max). These results could be applied to the expression of other plant enzymes.     

重组人uPA_(17)-KPI大规模发酵及纯化工艺的建立

目的建立重组人uPA17-KPI(rhuPA17-KPI)毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺。方法对工程菌表达rhuPA17-KPI的pH值进行优化。在摇瓶中制备rhuPA17-KPI工程菌种子2L,接种至80L发酵罐中,采用优化的pH值,补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,经甲醇诱导48h后结束发酵。将发酵液离心,经SP Sepharose XL阳离子交换层析和SourceTM 30 RPC反相疏水柱层析纯化。结果建立的发酵工艺为:控制发酵温度为28℃,pH值为5.5,溶氧值为25%～30%之间,在酵母细胞湿重达到190g/L时开始甲醇诱导表达,诱导30h,rhuPA17-KPI的分泌达高峰,为300mg/L发酵液。发酵上清经阳离子交换层析和反相疏水层析纯化后,获得纯度为95%以上的rhuPA17-KPI,产量为180mg/L,回收率为60%。结论已建立了rhuPA17-KPI毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺,为其产业化及临床应用奠定了基础。