北京棒杆菌天冬氨酸激酶G377定点突变及酶学性质表征

采用饱和定点突变和高通量筛选技术,对北京棒杆菌天冬氨酸激酶（aspartate kinase,AK）AK Gly377位点进行突变,并筛选获得高活力突变体G377F,分离纯化后对G377F AK酶学性质进行表征。结果表明：突变体AK最适pH值为9.0,较突变前野生型（wide type,WT）最适pH值为8.5有所提高;最适反应温度与WT一致,均为25 ℃;半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h;pH耐受性在5 h内保持其活力50%以上,与WT 3 h内酶活力保持能力相同。G377F对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性。其中,Lys的抑制作用在一定程度上被解除,当Lys和Met同时存在时对AK具有明显的激活作用。动力学研究显示：G377F AK Vmax较WT提高9.3 倍;n值为1.0明显低于WT的2.7,说明AK正协同性降低,趋向于米氏酶。     

天冬氨酸激酶突变体G277K中AK基因的克隆表达及酶学性质表征

通过序列比对和晶体结构分析发现,天冬氨酸激酶（aspartokinase,AK）的G277位点高度保守,并与抑制剂Thr通过氢键相连,对其进行定点突变和酶学性质表征。结果表明：突变体G277K的AK最适反应条件是30 ℃、pH 8.5;动力学实验结果显示突变体AK的正协同效应降低,趋向于米氏酶,参数S0.5、nH、酶比活力、Vmax分别是7.05 mmol/L,1.24、964.3 U/mg、32.143 U/（mg·min）;热稳定性实验显示,其30 ℃半衰期为2.3 h,3 h后酶活力丧失80%左右;Ni2+在低浓度时表现出显著的激活效应;有机溶剂丙三醇、异丙醇和二甲基亚砜的体积分数为1%时,对AK的酶活力有很好的激活作用,表明突变体AK对一些有机溶剂有一定的抗性;低浓度的赖氨酸和蛋氨酸对AK有激活作用。     

北京棒杆菌Corynebacterium pekinense天冬氨酸激酶P184M酶动力学分析及酶学性质表征

目的研究北京棒杆菌天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)184位点脯氨酸(proline,P)突变为蛋氨酸(DL-methionine,M)对酶动力学及酶学性质的影响。方法对北京棒杆菌AK家族同源序列比对,选择出高度保守且远离底物结合位点的Pro184位点,对其进行饱和定点突变,成功构建突变体P184M。结果动力学和酶学性质研究表明:P184M AK Vmax比WT(wide type)提高了5.06倍;n值为0.19,突变体由WT的正协同性变为负协同性,同时Km(mol/L)值增大;突变体AK最适pH为6.5,低于野生型最适pH 7.0;最适反应温度28℃,低于WT的30℃,适宜温度区间变窄;半衰期由WT的2.1 h降为1.2 h;金属离子、有机溶剂和抑制剂Thr+Met、Lys+Met、Thr+Lys+Met对突变株AK均表现出激活作用。结论突变体天冬氨酸激酶P184M的酶动力学性质和酶学性质改变显著,为构建高产蛋氨酸菌株提供了一定的参考依据。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶五突变体的构建及酶学性质表征

目的:天冬氨酸激酶（aspartate kinase,AK）是催化天冬氨酸族氨基酸合成的第一个关键别构酶,为了提高其活力,并削弱或解除末端产物赖氨酸（Lys）与苏氨酸（Thr）对AK的协同反馈抑制。方法:在获得的北京棒杆菌四突变体T379N/A380C/G171I/Y198N AK（NCIN AK）的基础上,发现G295位点与抑制剂Thr通过氢键相连且高度保守, 对G295位点进行定点饱和突变,提取质粒,转入大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达,采用高通量筛选获得酶活力显著提高的突变株,对野生型（Wild type,WT）、五突变体T379N/A380C/G171I/Y198N/G295L AK（NCINL AK）进行酶动力学研究和酶学性质表征。结果:成功构建五突变体NCINL AK,最大反应速率V_max为259 U/（mg·min）。与野生型相比,米氏常数K_m值由3.44 mmol/L减小到0.93 mmol/L,酶与底物结合更加紧密;希尔系数n值由2.73降为1.21,正协同性降低;最适反应温度由25 ℃提高到28 ℃,最适pH由8.0升至8.5,半衰期由4.7 h延长至5.2 h;五突变体NCINL AK较野生型WT AK,不同底物抑制剂浓度在0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L时,抑制作用被不同程度的减弱,甚至Lys抑制作用被完全解除,且在10 mmol/L Thr条件下有激活作用。结论:本实验获得酶活力提高87.20倍的五突变体NCINL AK,酶学性质得到明显改善,在一定抑制剂浓度范围内,基本解除Lys对AK的反馈抑制作用,Thr的反馈抑制得到一定缓解,提高了积累大量天冬氨酸族氨基酸的可能性,为构建高产天冬氨酸族氨基酸菌株提供参考,使甲硫氨酸（Met）等氨基酸的无污染、高效生产成为可能。     

重组鱼腥藻脂肪氧合酶定点突变及突变酶酶学性质研究

重组鱼腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）基因来自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定点突变技术将Ana-LOX的421位和40位的缬氨酸（Val）突变为丙氨酸（Ala）,获得突变体V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期为3.8 min。而突变酶V421A和V40A在50℃的半衰期分别为4.4 min和7.0 min。突变酶V421A/V40A的半衰期为8.3 min,与野生型Ana-LOX相比,提高了1.18倍。相对于野生酶,突变酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分别提高了4.83%、41.58%、80.07%。突变酶的最适反应温度均比野生酶（35℃）高5℃。改造后的突变酶更能适合工业生产的需要,对于实际应用具有重要价值。      

北京棒杆菌单体天冬氨酸激酶T379N/A380C/T65I/D173G突变体酶学性质表征及工程菌构建

选取天冬氨酸激酶抑制剂赖氨酸(Lys)的结合位点苏氨酸(Thr) 379和丙氨酸(Ala) 380、底物天冬氨酸(Asp)的结合位点Thr65、既是底物也是ATP结合位点的催化活性中心Asp 173,对4个关键残基位点进行定点饱和突变.采用高通量筛选方法成功构建突变体T379N/A380C/T65I/D 173G,与野...     

纳豆激酶与豆豉纤溶酶酶学性质比较研究

研究对纳豆激酶和豆豉纤溶酶的酶学性质进行了分析和比较,结果发现,二者最适pH值范围和温度基本一致,分别为pH7.0~9.0、50℃;纤溶酶活性在60℃以上迅速下降;纳豆激酶在pH6.0~10.0、豆豉纤溶酶在pH7.4~12.0时稳定性好;Mg2+对2种酶均有激活作用,Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+有不同程度的抑制作用,Cu2+的对纳豆激酶的有显著抑制作用。     

嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶A的H297F定点突变、表达及酶学性质变化

利用重叠延伸PCR技术对嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶XynA活性中心附近的H297位点突变为F。将XynA及XynA_(H297)F在大肠杆菌BL21(DE3)中实施了表达、纯化以及酶学性质研究。比较研究野生型木聚糖酶XynA和突变体XynA_(H297)P的酶学性质发现,突变前后木聚糖酶的最适反应pH值均为5.5,在pH 4~10的缓冲液中处理20 h后残余酶活均在90%以上,均具有较好的pH稳定性。XynA最适反应温度为70℃,80℃处理20min后只有10%的残余酶活;XynA_(H297)最适反应温度为75℃,且相同处理条件下XynA_(H297)仍具有30%左右的残余活性,说明突变体的热稳定性有一定程度提高。与XynA相比,XynA_(H297)F的动力学参数Km、Vmax和Kcat均增大,说明突变后酶对底物的亲和力降低,但催化速率有所提高。     

大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶定点突变及其酶学性质初步研究

L-谷氨酸脱羧酶（L-glutamate decarboxylase,GAD）是生物法生产GABA的关键酶,但是野生型L-谷氨酸脱羧酶的最适pH过低,这限制了它的工业应用。本文对编码来源于大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的gadB基因进行了定点突变,分别构建了表达野生型GadB和突变型GadBΔHT的基因工程菌。在获得高表达的基础上,对两个酶的最适温度、最适pH、温度稳定性和pH稳定性进行了系统研究,证实了突变酶GadBΔHT在保持了与野生型相当的催化活性的前提下,表现出更广泛的pH适应能力,在pH3.4⁶.2的范围内,仍能保持50%以上的催化活性。突变酶更能适应工业生产的需要,降低生产成本,对于实际应用具有重要价值。      

烟曲霉单宁酶Kex2位点突变及酶学特性表征

研究单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶切割位点(K315-R316)对酶学性质的影响。通过对单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶切割位点(K315-R316)进行定点突变,构建单点突变体AfTanR316A和缺失突变体AfTanΔKR。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳检测发现两突变体Kex2蛋白酶抗性明显增强。经对酶学性质对比发现,两突变体具有较低的催化反应温度和较强的稳定性。单宁酶的最适反应温度由40℃(野生型)降低到20℃(两突变体)。突变体AfTanΔKR和突变体AfTanR316A在pH 12.0条件下处理1 h后,剩余酶活力由野生型AfTanA的0%提高到85%和60%;而在50℃条件下处理1 h后,剩余酶活力由野生型AfTanA的2%提高到40%和21%,上述性质的改变有利于单宁酶在低温条件的应用和酶制剂的生产贮存。突变体AfTanR316A动力学参数K_m和V_max分别为1.149 mmol/L和10.427 mmol/(L·min),AfTanΔKR的动力学参数K_m和V_max分别为1...     

北京棒杆菌AS1.299高丝氨酸脱氢酶突变体D206G的酶学性质表征

高丝氨酸脱氢酶(HSD)是天冬氨酸族氨基酸合成途径的关键酶,在苏氨酸和蛋氨酸生物合成中起到重要作用。将来自于北京棒杆菌AS1.299的HSD在E. coli BL21(DE3)中成功构建并进行高效异源表达。通过分子对接与同源序列比对发现,206位点参与底物结合,并且在家族中高度保守,因此对突变体D206G进行研究。结果表明：突变体最适pH7.5,最适反应温度37℃,半衰期为4h,并对金属离子和有机溶剂显示出良好的抗性。同野生型相比,突变体Km值减小,可能是由于侧链官能团减小,空间位阻降低,有利于底物结合。     

多酚氧化酶的固定化及其酶学性质研究

游离多酚氧化酶在使用过程中容易流失,无法重复利用。文章主要研究了低成本、高效率的两种固定化方法:海藻酸钠包埋法和戊二醛交联法,确定了其最优固定化条件,分别为海藻酸钠包埋法:2.5%CaCl₂,2.5%海藻酸钠,固定化时间2h;戊二醛交联法:1.25%戊二醛,振荡固定pH 4.5,酶与载体质量比75(mg/g),固定化反应时间6.5h。同时对游离多酚氧化酶及固定化多酚氧化酶的酶学性质进行了研究。结果表明:游离酶、海藻酸钠包埋法固定多酚氧化酶(polyphenol oxidase immobilized by sodium alginate,A-PPO)和戊二醛交联法固定多酚氧化酶(polyphenol oxidase immobilized by glutaraldehyde crosslinking,C-PPO)的比活力分别为864,490,371U/mg,A-PPO和C-PPO的酶活回收率分别为18.6%和24.0%。同时,固定化酶在pH稳定性、热稳定性上优于游离酶,戊二醛交联法固定酶的效果优于海藻酸钠包埋法。     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺能够促进酶的活性,其中Ca²⁺激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。     

蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质测定

大蒜中功能成分含硫化合物是由蒜氨酸酶(alliinase,E C4.4.1.4)催化蒜氨酸(alliin)生成的。本实验通过提取、盐析、透析及层析,自新鲜大蒜中分离纯化出蒜氨酸酶,并测定了蒜氨酸酶的酶学性质。蒜氨酸酶的适宜分离纯化过程及条件为:pH7.0Na /K 磷酸缓冲液提取,45%饱和度NH4(SO4)2盐析,10000×g离心沉淀30min,pH6.5的Na /K 磷酸缓冲液溶解,截留1.4万分子量透析袋透析,Sephadex G-200层析,收集洗脱时间4.75h的洗脱液。蒜氨酸酶最适温度和pH值分别为30℃和6.3,Mg2 、Zn2 、Fe2 、Fe3 、EDTA-Na金属离子对蒜氨酸酶有激活作用,Fe3 激活作用最明显,Cu2 严重抑制蒜氨酸酶活性。以合成S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为5.91mmol/L、Vmax为1.55μmol/min。     

微泡菌昆布多糖酶Lam128A的酶学性质及酶解产物抗氧化活性

该研究探讨微泡菌ALW1来源的昆布多糖酶Lam128A的酶学性质及其酶解产物的抗氧化活性。利用毕赤酵母异源表达重组蛋白rLam128A,该昆布多糖酶的分子量为70 ku,最适反应温度和最适反应pH值分别为45 ℃和pH值5.5;温度低于45 ℃时稳定,分别在pH值3.0、5.0和11.0条件下处理96 h后,残余酶活力不低于60%。还原试剂二硫苏糖醇（DTT）对昆布多糖酶活力有促进作用,rLam128A对螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）表现出良好的稳定性,对去垢剂Tween 20和Tween 80、变性剂尿素表现出一定的稳定性。昆布多糖经rLam128A水解后,酶解产物对DPPH、ABTS和OH·自由基的半数抑制剂量IC50分别为7.12、1.01和 2.40 mg/mL,相比未经酶解处理的昆布多糖表现出更显著的抗氧化活性。微泡菌昆布多糖酶Lam128A的酶学性质为该酶开发利用昆布多糖生物资源提供了理论基础。