重组凝乳酶原在大肠杆菌中的表达及活性研究

为了提高干酪生产中起重要凝乳作用的凝乳酶的原核表达效率,分析了Genbank中牛、羊和骆驼凝乳酶原(prochymosin,pCHY)的保守序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,合成了凝乳酶原序列,并将其克隆至大肠杆菌原核表达载体上。经IPTG的诱导得到高效表达的凝乳酶原;Western blotting检测证明了其具有免疫原性;经pH值2到6活化后成功自剪切,得到大小约36 ku的有凝乳活性的凝乳酶。研究获得较高表达水平具有凝乳活性的重组凝乳酶。     

原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性

凝乳酶能够专一性裂解κ-酪蛋白,是制造干酪的关键酶。运用大肠杆菌表达系统对牛凝乳酶原进行了原核表达和初步纯化,活化重组凝乳酶原及测定凝乳活性,对重组凝乳酶的酶学特性进行分析。结果表明:大肠杆菌表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的66.3%,每升培养液可纯化约200 mg的重组凝乳酶原,活化后的凝乳酶活力可达600 000 SU/g。经测定凝乳酶最适作用温度为57⁶2℃,并在pH 262℃,并在pH 2⁷、低于40℃的温度范围内稳定。金属离子中Al3+,Fe3+和Cu2+能显著增强酶活;胃蛋白酶抑制剂pepstatin A对酶有明显的抑制作用。     

噬菌体基因Ⅴ蛋白基因的合成、重组表达及功能分析

目的:研究丝状噬菌体基因V蛋白(gene V protein,GVP)基因的合成、重组表达及其功能。方法:根据GVP的基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计合成了8个寡核苷酸片段,利用重叠延伸PCR合成GVP基因序列,将其与原核表达载体pET-28a-c(+)质粒重组,转化大肠杆菌,获得GVP蛋白阳性表达菌株,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,产物经Ni+-NTA琼脂糖凝胶层析纯化,获得目的蛋白GVP,DNA结合实验检测其功能。结果:成功合成出GVP基因,重组体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导获得高效表达,DNA结合实验表明GVP与单链DNA间解离平衡常数Kd=7.27×10-5mol/L。结论:重组构建并高效表达的GVP蛋白具有较高单链DNA结合能力,可用于食品病原微生物特定单链DNA分子的浓缩和分离。     

牛凝乳酶基因的克隆与表达

为了获得大量高纯度高活性的凝乳酶制剂,采用基因工程方法,从犊牛皱胃黏膜细胞中克隆得到凝乳酶基因,然后将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)-内含肽(intein)融合,从而获得原核表达质粒:pTWIN1/EchybF2.经转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG诱导下进行凝乳酶的表达.SDS-PAGE电泳分析和酶活性实验结果显示,CBD-intein-EchybF2融合蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在,并具有凝乳活性.     

EC-SOD在大肠杆菌中的可溶性表达

目的　在大肠杆菌中表达可溶性EC -SOD。方法　将表达质粒EC -pet2 8a(+)转入宿主菌BL2 1 (DE3)plysS中进行表达,在低温下培养含表达质粒EC -pet2 8a(+)的宿主菌BL2 1 (DE3) ,通过SDS -PAGE电泳,观察其在超声上清中的表达。结果　EC -SOD在BL2 1 (DE3)plysS中表达,其量比在BL2 1 (DE3)降低约2 0 %,上清中有明显表达;在2 0℃和1 5℃培养时,EC -SOD在BL2 1 (DE3)的超声上清中有表达。结论　EC -SOD在BL2 1 (DE3)plysS中或在BL2 1 (DE3)中低温培养,均可实现部分上清中的表达。     

牛凝乳酶原基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究

凝乳酶是制造干酪的关键酶。为获得高活性的牛凝乳酶（chymosin,B-chy）,用电脉冲法将线性化的pGAPZαA-B-pchy重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中。该菌株在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中可分泌表达牛凝乳酶原。SDS-PAGE分析表明所表达的牛凝乳酶,分子量约为37ku,符合预期大小。发酵培养96h后,酶活力达到96SU/mL。酶学特性分析表明,其最适凝乳温度为60℃,在pH2⁶、小于50℃的温度范围内稳定。Ca2+浓度为40mmol/L时,钙促酶反应活性达到最高,此后随着Ca2+浓度的增加酶活力逐渐降低。金属离子Al3+、Mn2+、Fe2+、Mg2+和K+对酶活力具有显著的促进作用,而Co2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+对酶活力具有显著的抑制作用。本研究优化了凝乳酶的表达条件,为凝乳酶工业化生产提供了理论基础。      

牛凝乳酶原基因在食品级乳酸乳球菌中的重组表达

将牛凝乳酶原基因连接pNZ8149载体,并转化乳酸乳球菌NZ3900,经乳酸链球菌素Nisin诱导,测得重组菌株胞内凝乳酶活力达到0.7 SU/mL,培养基中检测不到凝乳酶活力,实现了牛凝乳酶原基因在乳酸链球菌Nisin诱导基因表达系统（nisin controlled gene expression system,NICE）中活性表达。在此基础上,将分泌信号肽SPusp45连接于pNZ8149,构建了分泌型表达载体pNZ8149s,并实现牛凝乳酶原基因在NICE系统中分泌表达。当使用1 ng/mLNisin诱导5 h后,重组菌株胞内检测不到凝乳酶活力,培养基中凝乳酶活力为1.2 SU/mL,说明pNZ8149s能够促使凝乳酶原从乳酸乳球菌中分泌。该方法为重组牛凝乳酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案。     

米黑霉脂肪酶基因的高效表达及活性测定

为了实现米黑霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML)基因在大肠杆菌中的高效表达,并得到大量的具有生物活性的脂肪酶,首先通过3种方式提高RML在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量:1)低温诱导(16℃)RML表达;2)新型分子伴侣(Skp)与RML N端融合表达;3)载体pET32a上的Trx·tag与RML N端融合表达.其次对各蛋白质进行纯化及活性测定,各种条件得到的RML比活在(226±10～247±10) U/mg.蛋白质表达结果显示:经低温诱导RML的效果最好,纯蛋白质量浓度为0.86 mg/mL,表明诱导温度是影响可溶性蛋白质表达量的关键因素;活性测定结果表明,Skp和Trx· tag与目的基因N端的融合没有影响RML活性中心(C末端)对底物的结合和催化能力.因此,RML不仅在大肠杆菌中得到高效表达,并且保持原有生物学活性,在工业生产中有应用价值.     

重组干扰素-tau在大肠杆菌中的高效表达

目的研究重组干扰素-tau的纯化和复性。方法将构建好的重组质粒pBV220转化E.coli BL21,发酵培养后迅速升温至42℃诱导干扰素-tau以包涵体的形式高效表达。裂菌后利用8mol/L尿素溶解目的蛋白质,经凝胶过滤色谱层析纯化后,再透析复性。结果干扰素-tau的表达量占菌体总蛋白质量的20%以上,纯化后纯度可达9 6%以上,活性得到有效恢复。结论建立了干扰素-tau纯化及复性的方法,获得了高表达、高纯度、有活性的干扰素-tau。     

小牛凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的表达及遗传稳定性研究

目的:构建小牛凝乳酶原乳酸克鲁维酵母分泌型表达载体,表达重组凝乳酶原.方法:通过PCR获得小牛凝乳酶原cDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pKLAC1 α结合因子分泌信号下游,得到重组载体pKLAC1-prochymosin.SacII线性化后氯化锂转化乳酸克鲁维酵母GG799,用含5mmol/L乙酰胺的YCB固体培养基筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因,利用特异性引物筛选多拷贝转化子.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析并检测凝乳酶的活力,通过检测阳性转化子产凝乳酶的活力考察其遗传稳定性.结果:经测序及PCR证实,凝乳酶原cDNA准确插入酵母表达载体pKLAC1中,转化后重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明凝乳酶的分子量约为36kD,酸处理后测得培养基中凝乳酶的酶活为83SU/ml,阳性转化子遗传稳定性好.结论:成功构建出酵母表达载体pKLAC1-prochymosin,在培养基中获得分泌的重组凝乳酶原,经过酸处理后凝乳酶原转化为有活性的凝乳酶.     

玉米谷氨酰胺转胺酶基因的克隆及原核表达

从玉米嫩叶中提取总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出玉米谷氨酰胺转胺酶(TGase)全长基因,回收目的片段并测序,该基因编码区全长1605bp,编码535个氨基酸残基,分子量为60.9kD,与GenBank(登录号：AJ421525)上已发表的序列同源性为100%。按正确的阅读框架将玉米TGase基因片段定向克隆到表达载体pET-28a上,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,1mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,经凝胶分析软件测得蛋白表达量约占总蛋白的15%,以His-Tag抗体作为一抗,采用Western-blot方法检测目的蛋白,结果证明所表达的特异蛋白是带有His-Tag的重组融合蛋白,利用Ni2+-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定为单一条带,测得纯化后的TGase酶活力达到16U/mg。     

海洋假单胞杆菌褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性检测

利用PCR方法从假单胞杆菌基因组DNA扩增胞外褐藻胶裂解酶的全基因和缺损片段,构建表达质粒pQE30-aly32和pQE30-aly165,并在大肠杆菌M15中成功表达。表达的重组蛋白大部分存在于包涵体中,经洗涤,变性和复性,镍柱亲和层析纯化,获得了电泳纯的Aly32和Aly165。酶活性检测发现,仅Aly165具有较强活性,108 u/mg,该酶对poly(G)和poly(M)都有活性,对poly(M)更敏感。对表达体系进行优化,确定IPTG的最佳浓度为0.6mmol/L,最佳诱导菌液密度OD600为0.5~0.6,最佳表达时间为3h,28℃低温诱导可以提高重组蛋白的可溶性,可溶性蛋白相对表达量达到25%。     

转谷氨酰胺酶酶原在大肠杆菌中的重组优化表达

茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶酶原(pro-transglutaminase,pro-TG)在重组大肠杆菌中的表达量低,限制了其在食品、化妆品、纺织行业中的应用。通过对转谷氨酰胺酶酶原的基因序列进行密码子优化,降低其GC含量,提高了它在大肠杆菌中的表达水平,结果表明经优化后转谷氨酰胺酶原的表达量达到了优化前的4.4倍。为提高转谷氨酰胺酶的比活力,通过基于融合PCR的定点突变技术将转谷氨酰胺酶第二位的丝氨酸突变为脯氨酸,突变后转谷氨酰胺酶的比活力达到了突变前的1.26倍。上述研究结果表明,密码子优化及定点突变技术可以应用于优化转谷氨酰胺酶酶原在大肠杆菌中的表达。     

Expression of Soluble Thioredoxin Fused-Carp (Cyprinus carpio) Ovarian Cystatin in Escherichia coli

ABSTRACT: A DNA-encoding thioredoxin-carp ovarian cystatin (trx-cystatin) was ligated into pET-23a(+) and transformed into Escherichia coli AD494(DE3). High level of soluble recombinant trx-cystatin, expressed in E. coli was purified by 5 min of heating at 70 °C, Q-Sepahrose HP, and Sephacryl S-100 HR chromatographs. Its molecular mass was 28 kDa. It could be cleaved into a recombinant thioredoxin (16 kDa) and a mature carp ovarian cystatin (12 kDa) by enterokinase. The 12-kDa mature carp ovarian cystatin was further purified by FPLC Superdex 75 chromatography. Both recombinant trx-fused and carp ovarian cystatins were thermostable proteins and exhibited papain-like protease inhibition activity comparable to the wild-type cystatin.     

编码米曲霉果糖基转移酶基因在大肠杆菌中的重组表达

为了大量获得果糖基转移酶,本文通过RT-PCR扩增获得米曲霉果糖基转移酶基因,连接到大肠杆菌pEASY-E1质粒上,并转化到大肠杆菌BL21-DE3菌株中成功表达,通过对重组菌诱导表达条件的优化,最终确定在诱导温度为25℃,诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.0μmol/mL的条件下,该重组酶可以顺利表达。利用重组质粒PEASY-S1上的6×组氨酸标签,用亲和层析的方法纯化能够得到较高纯度的果糖基转移酶。以蔗糖为底物,用该酶进行果糖基转化生产低聚果糖的实验结果表明:重组果糖基转移酶具有一定催化能力,其酶活力达到59.0 U/g,且在低温诱导时稳定表达,具备一定的潜在开发利用价值。本实验成功在大肠杆菌中重组表达出果糖基转移酶,并且能够短时间内、大量表达具有催化活性的果糖基转移酶,可望为果糖基转移酶的工业化提供理论基础。     

华北地区乳房炎奶样中大肠杆菌的耐药性研究

为了解华北地区乳房炎奶样中大肠杆菌的耐药情况,本试验采集华北地区乳房炎奶样240批次,采用EMB培养基和菌悬液法对大肠杆菌进行分离鉴定,通过纸片扩散法对常用的八类29种抗生素进行药敏试验。试验结果表明共分离大肠杆菌17株(7.08%)。药敏试验结果显示大肠杆菌分离株表现出高度耐药和多重耐药。分离株对至少4种抗生素产生耐药性,最多耐药19种,耐药5种以上的菌株较多(58.82%);针对单一抗生素,分离菌株对青霉素、苯唑西林、林可霉素3种药物耐药率高达100%。针对不同种类抗生素,大肠杆菌分离株对β-内酰胺类药物和林可酰胺类药物的耐药率分别为55.15%,61.76%,均超过半数。本研究旨在发现乳房炎奶样中大肠杆菌的耐药性规律,并根据数据对奶牛乳房炎精准防控,减少牛乳中兽药残留,提升牛乳质量。