在我国获得登记首个高活性昆虫病毒杀虫剂

河南省济源白云实业有限公司生产的3种高效昆虫病毒生物杀虫剂获得农业部颁发的农药临时登记证,并获得国家发改委核发生产批准证。这3种昆虫病毒杀虫剂分别是“600亿P1B／克棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂”（登记证号LS20071438）、“300亿P1B／克甜菜夜蛾核型多角体病毒水分散粒剂”（登记证号LS20071689）、“200亿P[B／克斜纹夜蛾核型多角体病毒水分散粒剂”（登记证号LS20071905）。上述3种昆虫病毒杀虫剂分别用于防治棉花上的棉铃虫和十字花科蔬菜上的甜菜夜蛾、斜纹夜蛾。     

首个高活性昆虫病毒杀虫剂在我国获得登记

河南省济源白云实业有限公司生产的3种高效蔬菜昆虫病毒生物杀虫剂获得农业部颁发的农药临时登记证,并获得国家发改委核发生产批准证。这3种昆虫病毒杀虫剂分别是“600亿PIBI克棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂”（登记证号LS20071438）、“300亿PIB／克甜菜夜蛾核型多角体病毒水分散粒剂”（登记证号LS20071689）、“200亿PIB／克斜纹夜蛾核型多角体病毒水分散粒剂”（登记证号LS20071905）。     

甜菜夜蛾核型多角体病毒颗粒剂制备及其抗逆性能评价

甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)具有专一性和高效性,可以有效控制甜菜夜蛾种群,而且对环境和生态安全。为了提高甜菜夜蛾核型多角体病毒的稳定性,以海藻酸钠为包埋材料,通过优化载体用量和进料速率等条件,采用喷雾法制备了病毒颗粒剂,并对其相关性能进行了表征和评价。结果表明：海藻酸钠质量浓度为1%,进料速率为13 mL/min时制备的病毒颗粒剂呈不规则形状,颗粒剂产率79.4%,病毒含量1.0×10⁶ PIB/g,D50在130μm左右。经颗粒剂海藻酸钠包埋的甜菜夜蛾核型多角体病毒具有良好的热稳定性和抗紫外性能,同时不会影响其对甜菜夜蛾幼虫的致病力。     

重组人白细胞介素-4融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达的影响因素

目的　提高人重组白细胞介素 4 (rhIL 4 )在大肠杆菌中的表达量。方法　研究rhIL 4的体外诱导条件 ,包括诱导时间、IPTG浓度、诱导温度、菌体密度对表达量的影响。结果　最佳表达条件是诱导时间为 4h ,诱导温度为 4 2℃ ,A6 0 0 为 0 7～ 1 0 ,而IPTG的浓度对表达量无显著影响。结论　诱导时间、诱导温度和菌体密度的优化能提高外源基因在大肠杆菌中的表达产量。     

复合型甜菜夜蛾核型多角体病毒杀虫剂配方的筛选

甜菜夜蛾核型多角体病毒是甜菜夜蛾的一种重要病原微生物,仅对甜菜夜蛾有特效,为了进一步扩大其杀虫谱窄,文章开展了复合型甜菜夜蛾核型多角体病毒杀虫剂配方的研究。从多种生物源药剂中,筛选得到了对甜菜夜蛾核型多角体病毒具有较强增效作用药剂-虫酰肼。并采用等效线法获得了两者的最佳配比为15∶2,为联合应用这两种药剂开发新型生物杀虫剂提供了参考。     

白细胞介素-7基因慢病毒表达载体的构建及在CHO-K1细胞中的稳定表达

目的构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上,构建重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7,在HEK293T细胞中进行病毒包装,检测病毒滴度后,收获细胞毒液,感染CHO-K1细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达IL-7的CHO-K1-r IL-7细胞。荧光显微镜观察感染细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测IL-7基因m RNA的转录;ELISA法检测IL-7的含量;Western blot法检测IL-7的表达。结果重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7经双酶切及测序结果证明构建正确。慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。慢病毒感染CHO-K1细胞24、48和72 h后,均可见特异性绿色荧光蛋白表达,且随着培养时间的延长,荧光强度明显增强;CHO-K1-r IL-7细胞可扩增出约540 bp的IL-7基因片段;经ELISA检测,样品中IL-7含量为0.6 ng/ml;表达产物主要存在于CHO-K1-r IL-7细胞上清中,且具有良好的反应原性。结论成功构建了IL-7基因慢病毒重组表达质粒,并实现了IL-7在CHO-K1细胞上的稳定表达。     

甘蓝夜蛾核型多角体病毒等多种药剂防治水稻大螟田间药效试验

为筛选防治水稻大螟的有效药剂,开展了甘蓝夜蛾核型多角体病毒等7种药剂防治水稻大螟的田间药效试验。结果表明:30亿PIB/mL甘蓝夜蛾核型多角体病毒SC 1 200 mL/hm~2、10%阿维·甲虫肼SC 1 200 mL/hm~2、16 000 IU/mg苏云金杆菌WP 6 000 g/hm~2等3个药剂处理对3代大螟有较好的防治效果,且保穗效果良好。34%乙多·甲氧虫SC 450 mL/hm~2、33%阿维·抑食肼WP 600 g/hm~2对大螟有一定防效。100亿孢子/mL短稳杆菌SC 1 500 mL/hm~2和20%阿维·二嗪磷EC 1 500 mL/hm~2防效较低。     

白细胞介素2(~(125)Ser)在昆虫细胞中的高效表达

目的　高效表达白细胞介素 2 (12 5Ser)。方法　采用新型Bac -to -Bac杆状病毒表达系统 ,以PCR技术扩增了人白细胞介素 2 (12 5Ser)的基因片段 ,将其克隆到转座载体 ,经转座作用将白细胞介素 2 (12 5Ser)基因插入杆状病毒穿梭载体 ,在昆虫细胞中表达。结果　通过免疫印迹实验及CTLL - 2细胞 /MTT法检测 ,表达产物具有人白细胞介素 2的免疫学及生物学活性。经SDS -PAGE电泳 ,薄层扫描分折 ,表达量达到了 2 3.47%。结论　白细胞介素 2 (12 5Ser)在昆虫细胞中获得了高效表达。     

人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析,筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇,用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内,转化大肠杆菌ＢＬ２１,经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００,约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％,电泳显示单一条蛋白带,ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。     

凋亡细胞对巨噬细胞中白细胞介素-27表达的影响

目的探讨凋亡细胞对巨噬细胞中白细胞介素-27(Interleukin-27,IL-27)表达的影响。方法分别将小鼠巨噬细胞系RAW264.7(RAW细胞)和小鼠腹腔巨噬细胞分为6组:空白对照组、LPS刺激组、凋亡细胞刺激组、LPS+凋亡细胞刺激组、IFNγ+LPS刺激组及IFNγ+LPS+凋亡细胞刺激组。用IL-27 p28启动子荧光素酶报告基因瞬时转染RAW细胞,检测各组细胞中IL-27 p28启动子荧光素酶活性;RT-PCR法检测各组RAW细胞中IL-27 p28基因mRNA的转录水平,实时定量PCR法检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-27 p28基因mRNA的转录水平;Western blot法检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-27的表达水平。结果瞬时转染的RAW细胞中,IFNγ+LPS刺激组中IL-27 p28启动子荧光素酶活性明显高于空白对照组及IFNγ+LPS+凋亡细胞刺激组(P<0.05);RAW细胞与腹腔巨噬细胞中,LPS刺激组和IFNγ+LPS刺激组中IL-27 p28基因mRNA的转录水平明显高于空白对照组、LPS+凋亡细胞刺激组和IFNγ+LPS+凋亡细胞刺激组(P<0.05);LPS刺激组和IFNγ+LPS刺激组细胞中IL-27的表达水平明显高于LPS+凋亡细胞刺激组和IFNγ+LPS+凋亡细胞刺激组。结论巨噬细胞在摄取凋亡细胞后,IL-27 p28亚基的表达水平下降,从而导致IL-27的表达水平下降,为进一步研究其机制及临床应用奠定了理论基础。     

人IL-23R胞内区基因的克隆与原核表达

目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法通过PCR获得hIL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760bp的目的片段。重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为55000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功克隆了hIL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GST融合蛋白。     

分泌型rhGM-CSF/IL-2融合蛋白表达载体的构建

目的 将GM-CSF基因与IL-2基因通过一中间接头G-G-G-S-G-G-S-G连接到一起,并在E.coli中分泌表达具有更高GM-CSF和IL-2生物活性的融合蛋白分子。方法 在引物设计中,通过选择密码子,在Linker的中前部设计了一个BamHI酶切位点,GM-CSF的下游引物和IL-2的上游引物均起始于该位点。然后通过PCR、酶切、连接等一系列分子克隆的方法,构建融合蛋白的克隆及表达载体。结果 经EcoRI/SaII双酶切鉴定,克隆载体pUC19GM-CSF/L/IL-2及表达载体pBVGMCSF/L/IL-2中均插入了正确的外源片段。结论 克隆及表达载体的成功构建,为进一步表达融合蛋白及活性研究打下了基础。     

人LNα4链LG3-4组件的优化表达及活性检测

目的优化人层粘连蛋白α4链LG3-4组件基因在大肠杆菌中的表达条件。方法分别从诱导温度、诱导时间、IPTG浓度等方面进行优化。表达产物经Ni-NTA介质纯化,MTT法检测目的蛋白对人肺癌A549细胞粘附及增殖功能的影响。结果在20℃下,1mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白呈最佳可溶性表达;在37℃下,2mmol/L的IPTG诱导4h,呈最佳包涵体形式表达。纯化后目的蛋白纯度达96%,且具有良好的增强人肺癌A549细胞伸展和粘附的功能。结论已确立了hLNα4LG3-4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件。     

重组人IL-12真核表达载体的基因佐剂功能

目的探讨重组人IL-12真核表达载体(pcDNA6-p70)对核酸疫苗(HCMV pp65基因重组腺病毒,Adeno-pp65)的基因佐剂功能。方法pcDNA6-p70与Adeno-pp65共免疫BALB/c小鼠,每2周1次,共4次,同时设立Adeno-pp65对照组及生理盐水对照组。于初次免疫后第6周末尾静脉取血,第9周处死小鼠,分离脾细胞,分别检测细胞内细胞因子水平、CTL杀伤活性、特异性淋巴细胞增生和IFN-γ水平,并观察pcDNA6-p70对小鼠的安全性。结果共免疫组HCMV特异性CD4/IFN-γ、CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率均高于Adeno-pp65组及生理盐水对照组,差异均有显著意义;其CTL杀伤活性、HCMV特异性淋巴细胞增生水平及脾淋巴细胞特异性IFN-γ释放水平均高于Adeno-pp65组和生理盐水对照组,差异均有显著意义。pcDNA6-p70肌肉注射昆明小鼠,其体温、体重及一般情况与对照组差异均无显著意义。结论pcDNA6-p70与Adeno-pp65共免疫可提高核酸疫苗的免疫效果,且具有较好的安全性。     

狂犬病毒街毒株糖蛋白基因克隆、测序与表达

经实验研究证明狂犬病毒街毒株SBD0 7株具有较好的免疫原性后 ,通过RT PCR法 ,克隆了该毒株的糖蛋白 (G)基因 ,并进行了全序列测定。结果表明该株狂犬病毒G基因与疫苗株 (aG株 )的核酸及蛋白同源性分别为 85 8%和 88 5 %。以痘苗病毒为载体成功地表达了该基因 ,经小鼠实验表明能诱生较高滴度的狂犬病毒中和抗体 ,并能保护狂犬病毒致死量的攻击     

人源阳离子抗菌肽hCAP-18真核表达载体的构建与表达

目的构建人源性阳离子抗菌肽hCAP-18的真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,转染真核细胞,并检测其表达。方法以正常人外周血中性粒细胞的总RNA为模板,用RT-PCR技术钓取hCAP-18编码序列的全长cDNA,并克隆至pcDNA4/Myc-His真核表达载体上,转染真核细胞株HeLa。RT-PCR及Western blot方法检测目的基因的表达。结果所构建的真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,经酶切鉴定所释放片段大小与预期相符,基因序列与GenBank上登录的序列一致,目的基因在转染细胞中获得高水平表达。结论已成功构建真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,并在转染细胞中高效表达。     

人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体的构建

目的构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白。方法合成人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位的串联基因,克隆入pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-28a-H3,经酶切鉴定和DNA序列分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果重组载体pET-28a-H3酶切片段大小和DNA序列分析与预期结果一致。表达的目的蛋白相对分子质量约9400,与相应的多克隆抗体反应性良好。结论已成功构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体pET-28a-H3,并表达了目的蛋白,为制备单克隆和多克隆抗体奠定了基础。     

新城疫病毒TL1株L基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的对新城疫病毒TL1株L基因进行克隆、序列分析及真核表达载体构建。方法根据GenBank登录的新城疫病毒L基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR对内蒙古分离株TL1的L基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后,克隆入pGEM-Teasy载体,再亚克隆至真核表达载体pCI-neo上,通过酶切、PCR鉴定及测序进行验证。结果测序拼接得出L基因的全序列长度为6704bp,该基因的ORF总长为6615bp,编码2204个氨基酸。与GenBank登陆的12株参考毒株比较L基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株和SF02株的同源性极高,说明四者亲缘关系较近。结论已成功构建L基因真核表达载体,为对该株病毒进行反向遗传操作以及有关功能基因组研究奠定了基础。     

嗜人类T淋巴细胞病毒Ⅰ型核心蛋白P24基因的克隆与表达

目的 从感染HTLV-1的中国患者外周血单核细胞（PBMCs）中扩增编码HTLV-1核心蛋白P24的cDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法 提取感染者PBMCs基因组DNA,应用巢式PCR方法扩增出HTLV-1核心蛋白P24的cDNA并测序,与pGEX-20T载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达,采用ELISA和Westernblot分析重组蛋白活性。结果HTLV-1核心蛋白P24基因序列高度保守,构建重组载体后,在大肠杆菌中表达的重组蛋白,经检测具有较强的抗原活性。结论 成功地表达了HTLV-1型病毒的核心蛋白P24基因,为国产诊断试剂和疫苗的研发打下了基础。