重组人γ-型干扰素单克隆抗体的鉴定

5株小鼠杂交瘤细胞ID5、1C10、1C11、3H9和6F8，所分泌抗重组人γ－型干扰素（rIFN－γ）单克隆抗体经双扩散试验证明其中4种为小鼠IgG1型，另一种为IgG2b型。用ELISA间接法测定小鼠腹水抗体效价为1：8000～1：128000。经免疫印迹试验证实5种单抗均能特异地识别rIFN－γ，其中1D5、3H9和1C11单抗对rIFN－γ具有中和活性，中和效价＞1：8000，用2种单抗建立的ELISA夹心法检测rIFN－γ，最低可测值为10．0ng／ml，且与白细胞介素－2，重组人α和β干扰素无交叉反应。     

表达IFNα2b-HSA融合蛋白的CHO细胞培养基优化及发酵放大

毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2b和人血清白蛋白融合蛋白（IFNα2b-HSA）的CHO细胞株。在此基础上,本研究通过对12种国产商业化基础无血清培养基和5种流加培养基进行优化筛选,获得最适培养方案：基础培养基选择最适于生长的5号培养基（M2：M4=1：1）,流加培养基选择最有适于表达的F4培养基。在此基础上,进行5L生物反应器的发酵放大,pH为6.9～7.4,DO为40%～60%,细胞密度达到7.0×10⁶cells/mL时,温度由37℃降温至34℃,细胞活率降至80%时停止发酵,最终融合蛋白表达量达到137mg/L。初步实现了IFNα2b-HSA融合蛋白在CHO细胞中的高密度发酵。     

可溶型非融合血管生长抑制因子Kringle 5基因工程菌发酵培养和诱导表达条件的优化

在实验室试管培养条件下优化了基因工程菌E.coli BL21（DE3）pET15b/K5发酵产可溶型非融合血管生长抑制因子Kringle 5的培养基和诱导表达条件。经菌体干重测定和SDS-PAGE检测,确定最佳培养基（g.L-1）为：胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10.0,葡萄糖6.0,NH4Cl 2.6,NaH2PO45.0,Na2HPO46.0;优化的诱导表达条件为：诱导剂浓度0.01mmol.L-1,诱导时间6h,诱导温度37℃,摇床转速220r.min-1。在优化的培养基和诱导表达条件下,菌体干重为1.8g.L-1,Kringle 5表达量为360mg.L-1,占总蛋白含量的20%,与基础LB培养基相比,Krin-gle 5表达量提高了1.18倍。     

重组人干扰素α2b喷雾剂的研制

目的重组人干扰素α2b(以下简称为rIFNα2b)喷雾剂的试制及临床前实验。方法将重组人干扰素α2b原液进行稀释,调整pH和渗透压,加入适宜稳定剂,除菌过滤后分装于带有定量喷雾装置的棕色玻璃瓶。对配制好的制品分别进行理化和生物学试验、稳定性试验、鼻腔局部刺激性试验、急性毒性试验、长期毒性试验和动物体内抗病毒试验等。结果连续3批制品经检定各项指标均合格,2～8℃保存24个月后生物学活性无明显下降,使用安全,无不良反应。其他各项检定指标均符合现行《中国药典》的要求。结论研制的rIFNα2b喷雾剂安全、稳定,具有一定的抗病毒作用和潜在的临床应用价值。     

亮氨酸拉链结构蛋白基因的合成及其表达

为探讨亮氨酸拉链蛋白与DNA的结合机理,设计了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA的必需的35个氨基酸的折叠片段,并将其克隆到Escherichia coli BL21表达.以ZG1(+)、ZG1(-)、ZG2(+)、ZG2(-)、ZG3(+)、ZG3(-)寡聚核苷酸片段在PCR自动热循环系统连接得到亮氨酸拉链蛋白基因片段,将此片段克隆到pET3b质粒中,酶切后用2%琼脂糖电泳检测证明克隆成功,将这种重组质粒转化到E.coli DH5α,发现pET3b重组体在E.coli DH5α中表达成功,从转化子中分离得到重组质粒pET3b,序列分析证明插入序列为合成的亮氨酸拉链蛋白基因;将重组质粒pET3b在E.coli BL21于5 mL含有50 μg*mL-1氨苄青霉素和34 μg*mL-1氯霉素的LB液体培养基中以IPTG为诱导剂,37℃下表达,10%SDS-PAGE检测到外源基因蛋白质分子量为4000 Da左右;重组体在10 L含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中、28℃时能大量表达.     

α2a型基因工程干扰素发酵工艺的改进

应用自行设计的适宜PBV320／7118－α2a工程菌发酵的程序控制和“流加式”培养方法，各连续培养了3批工程菌，产量提高1倍以上，干扰素表达量提高1～3倍。该工艺稳定、简便、省时、省力。     

纤溶酶原饼环区5蛋白重组大肠杆菌高效表达体系的建立

目的　建立纤溶酶原饼环区 5 (Humanplasminogenkringle 5 ,hPK 5 )蛋白重组大肠杆菌高效表达体系 ,为高密度发酵创造条件。方法　观察一级、二级种子的生长状态 ,比较表达hPK 5蛋白的 4种重组工程菌株在相同条件下的表达情况 ,选出首选发酵种子 ;对其培养时间、诱导时间、培养基种类、pH等条件进行优化 ;并用凝胶成像分析系统对SDS PAGE结果进行分析。结果　经过筛选 ,JM10 9 pBV2 2 0 hPK 5 (简称JP5 )是获取hPK 5蛋白的首选工程菌株 ,其最佳表达条件是LB培养基 (pH 7.4、溶解氧充足 )、30℃培养 3h、4 2℃诱导 6h。在此条件下 ,JP5表达目的蛋白占菌体总蛋白的 38%左右。结论　为高密度发酵获取hPK 5蛋白奠定了实验基础     

重组α_(2b)型人干扰素工程菌菌种稳定性试验

重组α2b型人干扰素 (rIFN 2b)PBV889/JM10 3工程菌菌株传 10 0代后 ,经一系列检定表明 ,干扰素表达水平、质粒性状及其遗传稳定性、染色特性、菌落形态、电镜检查及其他理化特性均与原始菌种差异无显著意义 ,且无支原体及其他微生物污染 ,因此仍可作为生产用菌种     

重组人胰岛素样生长因子-1工程菌发酵培养基的优化

在摇瓶条件下,以M9培养基为基础,采用单因素实验和正交实验,对适合于表达重组人胰岛素样生长因子-1工程菌生长的高密度发酵培养基进行了优化。确定最佳培养基配方为：葡萄糖0．4％、甘油1．5％、酵母粉3％、胰蛋白胨3％、Na2HPO4 1．2％、KH2PO4 0．6％、NH4Cl0．1％、NaCl0．20％、MgSO4 0．048％,在此优化培养基中培养14h,工程菌菌体密度0D600达7．5。     

α_1型基因工程干扰素滴眼剂治疗单疱角膜炎的Ⅱ期临床研究

用rIFN－α1滴眼剂和0．1％ACV滴服刑（有效对照药）共治疗单疤角膜炎（HSK）359例。从症状改善、病变修复、炎症消退、视力改变等方面观察疗效。rIFN－α1组221例，ACV组138例，总治愈率分别为83．26％和8841％。统计学处理两药疗效差异无显著意义。结果表明rIFN－α1滴眼剂是治疗HSK的良好药物，对眼和全身无明显毒、副反应。     

干扰素α2b基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建干扰素α2b(IFNα2b)基因真核表达质粒,并在CHO-dhfr-细胞中表达。方法从DH5α-pbv220-IFNα2b工程菌中扩增IFNα2b基因片段,克隆入psv-dhfr质粒中,构建重组真核表达质粒psv2-dhfr-IFNα2b,转染至CHO-dhfr-细胞中,经MTX加压筛选,获得稳定生长的单克隆细胞株。采用Wish细胞病变抑制法检测转染细胞中IFNα2b的抗病毒活性;提取细胞基因组DNA,进行PCR鉴定。结果重组真核表达质粒psv2-dhfr--IFNα2b经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;转染后的重组细胞表达的IFNα2b具有抗病毒活性,且活性较强;以转染细胞基因组DNA为模板,可扩增出IFNα2b基因条带。结论已成功构建IFNα2b基因真核表达质粒,并在CHO-dhfr-细胞中表达了具有生物学活性的IFNα2b蛋白,为进一步对IFNα2b进行真核表达的研究奠定了基础。     

pRL-hTNF/JM103工程菌发酵和rhTNFα表达的研究

为便于下游中试规模生产,采用温度敏感型启动子PRPL构建rhTNFα工程菌,并对影响工程菌发酵培养和表达的因素进行了初步研究。结果显示,采用RTB培养基,50℃热水快速升温,诱导培养4～4．5h,湿菌体收获率和表达量均达到较高水平;50L发酵罐连续发酵3批,14000r／min连续离心,菌体收获率湿重达16．gg／L培养物,rhTNFα表达量占菌体总蛋白的10.5％,活性达1．35×107U／mg蛋白。.     

重组基因工程菌几丁质酶C的可溶性表达研究

在不同培养温度条件下对产几丁质酶C的基因工程菌BL21（DE3）进行诱导,使其表达可溶性蛋白.随后在较佳培养温度诱导条件的基础上向培养基中添加不同浓度的甘油,甘氨酸,山梨醇/甜菜碱等成分来更进一步的提高几丁质酶C的可溶性表达.其结果是在25℃诱导条件下,以添加2g/L葡萄糖的LB培养基作为基础培养基进行培养,在基础培养基中添加3g/L甘油的总酶活最高,达到了18.17 U/mL,较之仅含2g/L葡萄糖的LB培养基在37℃及25℃诱导培养条件下酶活力分别提高了41.6％和20.3％;添加0.3％甘氨酸约90％的可溶性几丁质酶表达到了胞外,胞外酶活达到14.68 U/mL;添加0.5 M山梨醇/2.5 mM甜菜碱工程菌胞内酶活达到最高,为8.43 U/mL.结果表明适当降低工程菌诱导表达时的培养温度提高了几丁质酶C的可溶性表达,在较佳温诱导表达的基础上向培养基中添加不同浓度的甘油,甘氨酸,山梨醇/甜菜碱更进一步的提高了几丁质酶C的可溶性表达.     

Nocardia sp.RS合成腈水合酶过程及其高酶活的表达工艺

对Nocardia sp．RS合成腈水合酶的过程进行了分析，研究了菌体生长和酶活表达的相互关系、pH调控和葡萄糖消耗对产酶速率的影响．根据腈水合酶在发酵过程中的生成特性，设计开发了葡萄糖—Co^2 耦合补加工艺优化产酶过程，通过对产酶过程的优化，大大提高了腈水合酶的发酵水平，酶活达到了10195U／ml，比优化前提高了43．2倍．     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

应用pET系统表达rhIFN-α2b基因的研究

目的 以构建的pET28a为表达载体,探讨人 IFN-α2b基因在pET系统中的表达。方法 合成引物,通过PCR扩增人 IFN-α2b基因并引入点突变,在不改变天然 IFN-α2b氨基酸序列的前提下,使原 IFN-α2b基因4个大肠杆菌稀有密码子改变为偏爱密码子,在起始密码子后,编码前16个氨基酸的碱基序列均成为大肠杆菌的偏爱密码子。将PCR产物次级克隆人pET28a载体,构建重组表达载pET28a-IFN-α2b。筛选正确的重组表达质粒pET28a-IFN-α2b转入感受态表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,粗提并检测 IFN-α2b活性。结果 重组质粒pET28a-IFN-α2b在宿主菌 BL21(DE3)中表达出的rhIFN-α2b以可溶性蛋白形式存在于粗提上清液中,与原来 pBV889系统表达的干扰素相比,具有更高的生物学活性。结论 应用pET表达系统可表达出具有更高生物学活性的rhIFN-α2b蛋白。     

应用统计学分析方法优化乳链菌肽发酵培养基

以CM培养基为基础,采用Plackett—Burman设计法对影响乳链菌肽液体发酵培养基的组分（蔗糖,蛋白胨,酵母膏,K2HPO4,NaCl和MgSO4·7H2O）进行了筛选,发现影响乳链菌肽效价的关键因素为蔗糖,蛋白胨和K2HPO4,然后采用最陡爬坡实验逼近3个关键因素的最大响应区域,得出合适的中心点为蔗糖15．8g／L,蛋白胨19．0g／L,K2HPO4 18．3g／L。在此基础上,采用Box—Behnken设计结合响应面法对影响乳链菌肽效价的关键因素最佳水平作了进一步的研究,最优的培养基组分为蔗糖17．3g／L,蛋白胨17．0g／L,K2HPO4 23．0g／L,酵母膏10．0g／L,NaCl2．0g／L,MgSO4·7H2O 0．2g／L。在此培养条件下,得到乳链菌肽效价为6033IU／mL,是优化前的4．48倍。     

发酵培养中葡萄糖对超螺旋质粒DNA产量的影响

本文首先研究了含有不同质量浓度葡萄糖的发酵培养基对超螺旋质粒DNA产量的影响。结果表明,发酵培养基中最佳葡萄糖的质量浓度为2 00g L。此培养基与未添加葡萄糖的培养基相比,超螺旋质粒DNA产量提高2 56倍;菌体密度提高1 26倍。其次研究了优化培养基下影响超螺旋质粒DNA产量的各参数变化规律。     

玉米浆对大肠杆菌JH-B22发酵产L-丙氨酸的影响

为了进一步降低L-丙氨酸的生产成本,以大肠杆菌JH-B22为发酵菌株,以玉米浆为氮源、葡萄糖结晶废糖液为碳源进行L-丙氨酸的发酵。结果表明,发酵培养基中玉米浆添加量为20g·L~(-1)较为适宜。在玉米浆发酵培养基中进行L-丙氨酸的发酵,L-丙氨酸产量和糖酸转化率分别为54.30g·L~(-1)和90.5%;其L-丙氨酸产量略低于无机盐发酵培养基的56.12g·L~(-1)和LB发酵培养基的56.48g·L~(-1),但玉米浆发酵培养基具有配制更简单、无需额外添加无机盐或者成本较高的酵母粉等优点,可作为L-丙氨酸发酵生产的不错选择。     

Al-MCM-41沸石负载纳米CdS光催化分解硫化氢制氢研究

采用离子交换-沉积法,制备出CdS／Al-MCM-41负载型光催化剂（CdS／M41）,利用UV—Vis、XRD、ICP—AES和SEM—EDS等测试手段对催化剂进行了表征。分析结果表明,CdS已进入Al-MCM-41孔道内;CdS为六方晶系,CdS的引入没有改变沸石骨架的有序结构及其形貌特征;UV—Vis吸收边出明显蓝移,是量子尺寸的体现。考察了不同反应介质中,CdS／M41光催化分解硫化氢制氢性能。实验结果表明,以0．35mol／LNa2S～0．25mol／LNa2SO3的混合水溶液为反应介质时,CdS／M41光催化产氢速率可达43．96mmol／g·h cat．（CdS）,是纯CdS光催化剂的9．85倍。