重组腺病毒介导的人凝血IX因子cDNA在奶山羊乳腺中的分泌表达

利用含ｈＦＩＸ ｃＤＮＡ和腺病毒片段的质粒ｐＡｄＣＭＶｈＦＩＸ与质粒ｐＪＭ１７共转染２９３包装细胞，制备含ｈＦＩＸ的重组腺病毒颗粒，经纯化、浓缩后通过直接转染活体奶山羊乳腺小叶的方法，建立了ｈＦＩＸ蛋白的乳腺表达系统。转染处理４天后，ｈＦＩＸ蛋白在羊奶中的最高表达量为２１ｎｇ／ｍｌ乳汁，活性检测表明乳汁中的人凝血ＩＸ因子蛋白８０％以上具有生物学活性。此研究结果证实了人凝血ＩＸ因子全长ｃＤＮＡ在奶山     

表达人白细胞介素—2的重组腺病毒的制备

携带人白细胞介素－２ ｃＤＡ序列的Ｅ１区缺陷的腺病毒载体ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＬ２－ｂｐＡ与ｐＪＭ１７质粒，通过磷酸钙沉地共转染２９３细胞，经同源重组，获得了一个腺病毒噬斑。抽提腺病毒ＤＮＡ，运用ＰＣＲ扩增及ＸｂａＩ酶切检测，证实这一噬斑为带有人ＩＬ－２ ｃＤＮＡ序列的重组腺病毒。受其感染的２９３细胞和人黑素瘤Ａ３７５细胞上清中，都能够测出ＩＬ－２的活性，表明制备的重组腺病毒是能表达人ＩＬ－２的。     

腺病毒载体介导的人凝固因子IX基因的离体和活体表达

为血友病Ｂ的基因治疗探索了高效转移和表达载体，建立了重组腺病毒载体介导的基因转移系统，并进行了离体和活性表达研究。     

人组织型纤溶酶原激活剂乳腺定位表达载体的构建及其表达

将编码人组织型纤溶酶原激活剂的１７６６ｂｐ基因片段插入大鼠β－乳酪蛋白启动子的下游及ｐＳＶＬ质粒的ＰｏｌｙＡ上游。构建了ｐβ－Ｃａｓｅｉｎ－ＰＡ、,ｐβ－Ｃａｓｅｉｎ－ＰＡ２两个乳腺定位表达载体。将其分别与脂质体混合制备转染液后,直接注入妊娠２９天的青紫蓝母兔乳腺中。结果表明：两种载体均能在乳腺中表达,且具有溶纤活性,表达量在２００￣５００ｇｎ／ｍｌ之间,这不仅证明了所构建载体可用于转基因乳腺生物     

蚓激酶乳腺组织特异性表达载体构建及在山羊奶中的表达

以合成的蚓激酶cDNA突变体为目的基因,构建了其乳腺组织特异性表达载体pIbCP-LK-neo和含有两个目的基因拷贝的表达载体pIbCP-LK-LK。以山羊乳腺作为生物反应器,在稳定泌乳期于乳腺组织分别注射以上两种表达质粒,采集乳汁,通过纤维蛋白平板溶圈试验进行纤溶活性测定。结果显示,注射了蚓激酶表达质粒的山羊奶具有明显的纤溶活性;pIbCP-LK-LK蚓激酶在奶中的表达量高于pIbCP-LK-neo。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析表明,表达的蚓激酶分子量为26kDa。本试验系首次实现了蚓激酶的基因工程表达,为通过转基因途径生产蚓激酶奠定了基础。     

腺病毒载体介导的人凝血因子IX基因的离体和活体表达

为血友病Ｂ的基因治疗探索了高效转移和表达载体，建立了重组腺病毒载体介导的基因转移系统（Ａｄｈｆｉｘ），并进行了离体和活体表达研究。结果显示：腺病毒离体基因转移效率可达９８％以上并可在多种细胞中高效表达，ｈＦＩＸ蛋白最高可达６．８６μｇ／１０６细胞／２４ｈｒ。小鼠血浆中ｈＦＩＸ蛋白含量最高可达１０７２ｎｇ／ｍｌ血浆，并可持续表达１０周左右；以腹腔注射效果最好；免疫抑制剂环磷酰胺可明显延长表达持续时间。结果表明重组腺病毒载体可介导ｈＦＩＸｃＤＮＡ在离体细胞和活体组织中高效转移和表达。     

高表达重组人粒细胞集落刺激因子cDNA的中国仓鼠卵巢细胞株的建立

用质粒ｐＥＦ－ＢＯＳ的增强子、肽链延长因子基因的启动子及其第一内含子替换质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ的增强子，腺病毒主要晚期启动子及杂合内含子。构建成了更高表达质粒ｐＥＦ－ＧＣＳＦ，转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入并逐渐升高氨甲喋呤的浓度。结果显示：一定范围内，随着ＭＴＸ浓度增高，重组人粒细胞集落刺激因子表达量随之提高；筛选并建立了一株稳定高表达ｒｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ的细胞株，其表达量为５．０￣５．６μ     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

人硒蛋白SelK在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建硒蛋白SelK的重组表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP.方法:利用PCR、酶切和连接酶连接等技术将硒蛋白selk连接到质粒pGEX-6P-1上,通过酶切、序列测定进行鉴定.通过IPTG诱导重组载体在BL21大肠杆菌中表达,并筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间.结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的SelK-GFP融合蛋白,占菌体总蛋白的15%,主要以包涵体形式表达.结论:成功构建了pGEX-6P-1-SelK-GFP重组表达质粒,为进一步研究硒蛋白SelK的功能、抗体制各打下了基础.     

中国人IL－9cDNA的亚克隆及其高效表达

在完成了ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的克隆及序列测定的基础上，为实现ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ在原核细胞中的表达，重新合成了上游引物（在酶切位，久后加上ＡＴＧ）。以ｐｕｃ１９－ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，特异产物经ＥｃｏＲＩ酶切、回收后与经ｓｍａｌＩ、ＥｃｏＲＩ酶切的ｐＢｖ２２０载体连接，转化大肠杆菌。转化子质粒用０．８％ａｇａｒｏｓｅ电泳粗筛，经ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ酶切后得到了３个阳性克隆。３个阳性克隆经热诱导后，在ＰａＰ＿Ｌ启动子作用下，获得了天然ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的高效表达，表达量分别达到可溶性总蛋白的３７．３％、４３．８２％、５４．５２％。     

人凝血因子IX在脆壁克鲁维酵母中的表达与分泌

通过改造人凝血因子IX基因(h-FIX)使其与乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的分泌信号序列(Kss)融合，并置于脆壁克鲁维酵母(K．fragilis)LAC4基因调控型启动子的控制之下，构建成h-FIX基因表达盒。将此表达盒插入克鲁维酵母的整合质粒，得到了一个高稳定的h-FIX基因整合表达载体pHKB202-FP。经摇瓶培养并以半乳糖诱导此表达载体转化的酵母菌株，ELISA检测显示酵母上清液中的人凝血因子IX表达量可达到约200ng/ml。此结果表明人凝血因子IX蛋白首次成功地在脆壁克鲁维酵母中得到了表达和分泌。这对于促进人凝血因子IX的基因工程产业化具有实际意义。