抗流感病毒鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备和性质

用流感病毒免疫产蛋鸡,获得的免疫卵黄经两步盐析和一步凝胶过滤分离得到的IgY经SDS-PAGE分析其纯度在95%以上,纯化的IgY经胃蛋白酶(pH=4 0,37℃)酶解后,得到的片段抗体为Fab。采用竞争抑制ELISA法对IgY和Fab的免疫反应活性进行了对比,表明IgY经胃酶切解后保留了约70%的反应活性。     

人免疫球蛋白G酶解制备Fab和Fc片段及其分离纯化

为了制备抗体Fab和Fc片段,采用木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G(IgG),通过优化酶解条件和色谱法分离过程,得到了纯度较高的Fab片段和Fc片段。考察了酶解pH、酶加入量、添加半胱氨酸和酶解时间等对IgG酶解过程的影响,优化了酶解条件,提高酶解效率,IgG转化率大于98%。酶解产物通过Protein A亲和色谱法和DEAE阴离子交换色谱法进行了纯化,分离得到Fc片段和Fab片段,收率分别为72.6%和40.1%。经SEC-HPLC分析,Fc片段纯度达95.7%,Fab片段纯度达96.6%。     

重组人抗HBs-Fab抗体的纯化及结构分析

目的研究重组人抗HBs-Fab抗体的纯化工艺,并对其结构等特性进行分析。方法采用离子交换-分子筛层析法分离纯化由酵母工程菌(GS115/Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并经ELISA检测其抗体活性,等电聚焦电泳法检测其等电点(pI),基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测其相对分子质量和肽质量图谱。结果纯化的重组Fab抗体的纯度可达90%以上,经Sephacryl-100进一步层析后,纯度达99%以上,总收率可达80%以上。Fab抗体具有较好的抗体活性,其pI值为7·6,为一碱性蛋白,相对分子质量为50494,比其理论值约多2579·35,经Endoglycosidase H内切酶消化后的相对分子质量为49609,证明Fab的一级结构中有糖基化现象,且分布于Fab抗体的H链和L链上。胰酶酶解肽段中有21个与理论肽段相符,另检测到1对二硫键正确。结论已建立了重组人抗HBs-Fab抗体的稳定的纯化工艺,且Fab抗体的一级结构正确。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白功能性片段的原核表达及其免疫保护性

目的表达猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)的功能性片段(tmrp),并检测其对小鼠的免疫保护性。方法将构建的重组克隆载体pMD-tmrp经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将切下的目的基因tmrp亚克隆至原核表达载体pGEX-3X中,转化E.coliBL21(DE3),鉴定正确后,用IPTG诱导,谷胱甘肽亲和层析纯化GST-tmrp,免疫BALB/c小鼠,测定其免疫保护率。结果阳性工程菌经IPTG诱导,表达了可溶性目的蛋白,相对分子质量约为73000。0.8mmol/LIPTG,37℃,pH7.2诱导4h,表达量最高,为25.36%。经亲和层析纯化,融合蛋白纯度达93.7%。免疫BALB/c小鼠后,免疫保护率可达60%。结论已成功获得了具有免疫活性的GST-tmrp。     

噬菌体展示抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子的筛选和序列分析

目的　从自建的免疫噬菌体展示Fab抗体库中获得抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子 ,并进行基因序列分析。方法　采用纯化的乙型肝炎病毒表面抗原作为包被抗原 ,对自建的 4× 10 5Fab噬菌体抗体库进行富集筛选 ,从阳性强的次级库中挑选单个克隆菌 ,分别进行噬菌体ELISA、PCR和限制性内切酶鉴定后 ,再选取三者均为阳性的克隆菌进行基因序列分析。结果　共挑选了 6 0个单克隆菌株 ,其中噬菌体ELISA阳性有 2 7个 ,阳性率为 4 5 % ;PCR鉴定均为相应大小片段 ;限制性内切酶鉴定表明 2 7个阳性克隆菌中有 13个具有约 15 0 0bp的片段 ,其余均为约 75 0bp大小 ;BstOI酶切鉴定表明各克隆菌的酶切方式不同 ;选取 5个含约 15 0 0bp片段和 2个含约75 0bp片段的克隆菌株 ,经测序均为人免疫球蛋白基因 ,且重链分别属于VH3、VH4、VH5家族 ,轻链分别属于L5、L6、L8和 0 12 /0 2家族。结论　从自建的免疫噬菌体展示Fab抗体库中成功地获得了抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子。表明所构建的抗乙型肝炎病毒表面抗原的Fab抗体库的抗体基因具有多样性。     

低聚壳聚糖的复合酶法制备研究

通过对黏均分子量、酶活力、水解率和还原糖浓度的测定,研究了由商业α-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶1∶1∶1(m/m/m)组成的复合酶降解壳聚糖的最佳工艺条件,结果表明:复合酶在酶底物比为1∶5(m/m)、pH 5.3、温度56℃的条件下,酶解2 h可得到分子量为1 000～4 000的低聚壳聚糖,且通过傅里叶红外光谱分析酶解后的产物结构无明显变化。     

褐煤裂解中功能活性有机分子的生产

申请(专利权)人:种子生物科学私人有限公司申请日期:2007.11.02申请(专利)号:200780049144.4主分类号:C05F11/02(2006.01)I比例、褐煤的质量等。由于这些有机分子是褐煤裂解的产物,经过氧化氢或碱性过氧化氢的处理而增强了反应性,因此这些有机分子更具功能活性。这些功能活性有机分子在各个领域中比如医学和农业中都有应用。通过用过氧化氢或者碱性过氧化氢裂解褐煤生成一种分子量明显低于1000的不同分子量的新型功能活性有机分子,上述功能活性有机分子的分子量根据反应条件而发生变化,如过氧化氢的浓度、反应时间、反应温度、过氧化氢与褐煤的     

人源性抗甲型肝炎病毒Fab噬菌体抗体分子的初步筛选

目的从自建的大容量非免疫Fab噬菌体抗体库中筛选具有抗甲型肝炎病毒(HAV)抗原活性的噬菌体抗体,并进行鉴定。方法采用纯化的甲型肝炎病毒作为包被抗原,对自建的容量为1.26×1011pfu/ml的Fab噬菌体抗体库进行筛选和富集,分别对原始库和筛选后的抗体库进行Phage-ELISA和活性检测,经酶切鉴定和DNA测序分析后进行诱导表达。结果经2轮筛选,抗-HAV抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,ELISA检测证实其具有良好的抗甲肝病毒抗原的特异性,抑制率为38.61%。酶切鉴定表明抗体库重组较稳定。SDS-PAGE检测显示Fab抗体蛋白在E.coliDH5α中得到了表达。结论从自建的非免疫Fab噬菌体抗体库中成功获得了抗甲肝病毒噬菌体抗体,所构建的非免疫抗体库可用于人源性抗体的筛选。     

人A组和B组鼻病毒3C蛋白表达、纯化及酶切活性验证

目的在大肠埃希菌中表达人A组和B组鼻病毒(rhinovirus,RV)3C蛋白,纯化后检测其酶切活性。方法分别将A组鼻病毒RV1B和B组鼻病毒RV6的3C蛋白编码基因克隆至原核表达载体p ET-30a中,构建重组原核表达质粒p ET-30a-1B-3C和p ET-30a-6-3C,转化至E.coli BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化。利用具有3C蛋白酶切位点的15VP1-6P蛋白,分析不同温度(4和37℃)下3C蛋白的酶切活性。结果原核表达的目的蛋白为带His标签的可溶性蛋白,RV1B-3C蛋白相对分子质量约25 000,RV6-3C蛋白相对分子质量约23 000,纯度可达约70%。RV1B-3C和RV6-3C蛋白对15VP1-6P蛋白均具有酶切作用,而且在4和37℃均有酶切活性。结论在大肠埃希菌中成功表达了具有酶切活性的A组和B组鼻病毒3C蛋白,为进一步研究鼻病毒的致病机制奠定了基础。     

蓝圆鲹蛋白的酶解过程动力学研究

为了探索定向制备蓝圆鲹蛋白活性多肽的工艺条件,进行了酶解体系的动力学研究。蓝圆鲹蛋白经碱性蛋白酶在一定条件下作用可得到活性多肽。采用pH-stat法建立了蓝圆鲹蛋白-碱性蛋白酶酶解体系的酶解反应动力学模型。利用高效体积排阻色谱分析了不同水解度下酶解产物中多肽片段族分子量的分布,并采用3-D图形表达了酶解过程中水解度-多肽片段族分子量-质量百分数之间的变化关系,经Matlab数学拟合得到了酶解过程中多肽片段族组分百分数与水解度和分子量的关系。验证实验表明,建立的3-D动力学模型与实际水解过程基本吻合,该模型揭示了酶解过程中多肽分子量组成的变化规律,可对酶解体系进行实时定量分析和动态表征,此酶解过程动力学研究也有利于定量获得定向目标产物。     

牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕的制备及裂解条件的优化

目的制备牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕,并对裂解条件进行优化。方法将裂解质粒pHH43电转入牛肠产毒素性大肠埃希菌中,37℃培养至A_(600)值为0.6时,升温至42℃诱导裂解,制备菌蜕。同时对起始诱导A_(600)值(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2)和培养基成分含量(2/3、3/4、4/5和正常含量)进行优化,并计算裂解效率。结果在起始诱导A_(600)值为0.6,培养基营养成分为正常含量的3/4时,裂解效率最高,达99.93%。结论成功制备了牛产肠毒素性大肠埃希菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为进一步开展对其免疫效果和佐剂效应等研究奠定了基础。     

西尼罗病毒抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及其应用

目的建立及验证西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)抗体间接ELISA检测方法,并用于评价疫苗的免疫效果。方法以纯化后的WNV E蛋白第三结构域(EDⅢ)蛋白作为包被抗原,建立WNV抗体间接ELISA检测方法,对抗原包被浓度(2.5、5、10、20、40、80μg/ml)、血清稀释度(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320)、抗原封闭时间(0.5、1、1.5、2 h)、血清孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)、HRP标记的山羊抗马Ig G稀释倍数(1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:40 000、1:80 000稀释)及其孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)进行优化,并验证该方法的特异性、敏感性及精密性。采用建立的方法检测WNV阴性马血清和病毒样颗粒(WNV-VLPs)疫苗免疫的马血清,与ALPHA公司试剂盒的检测结果进行比较。结果间接ELISA法最佳检测条件为:抗原包被浓度为20μg/ml,4℃包被过夜;Blocking ACE封闭液于37℃封闭1.5 h;加入血清(1:80稀释),37℃孵育1.5 h;加入HRP标记的山羊抗马Ig G(1:20 000稀释),37℃孵育1 h。该方法可特异性检测WNV阳性血清中的WNVE-Ig G抗体;阳性血清稀释至1:2 560时,检测结果仍为阳性;批内和批间的变异系数(CV)均小于7%。25份WNV阴性马血清检测结果均为WNVE-Ig G抗体阴性,经WNV-VLPs疫苗免疫的马血清中的WNVE-Ig G抗体效价水平随免疫次数的增加呈递增趋势,间接ELISA法与ALPHA公司试剂盒的检测结果完全一致。结论成功建立了WNV抗体间接ELISA检测方法,可用于疫苗免疫效果的评价,为开展WNV流行病学调查、诊断及新型疫苗的研发奠定了基础。     

压力反应釜中低温热裂解废旧LLDPE塑料制备PE蜡

以废旧线性低密度聚乙烯(LLDPE)为原料,采用压力反应釜在封闭条件下通过热裂解方法制备聚乙烯蜡(PE蜡),研究了裂解时间、温度和压力对产物的产率、分子量和滴熔点的影响,并通过红外光谱对产物的官能团进行了分析。实验结果表明,在裂解时间为15～60 min,裂解温度约为260℃的条件下,LLDPE裂解所得到的PE蜡性能较佳,其主要成分为直链烷烃和烯烃,滴熔点大于100℃,黏均分子量处于1400～4700;由动力学分析可知,由于封闭反应体系增加了反应压力,降低了裂解温度和活化能,促进了LLDPE裂解反应进行,同时抑制了气体分子的产生,有利于获得PE蜡。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D胞外区片段在哺乳动物细胞中的表达及其免疫活性

目的在哺乳动物细胞中表达单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type-2,HSV-2)糖蛋白D(GlycoproteinD,gD)胞外区片段,并分析其免疫活性。方法化学合成HSV-2 G株gD蛋白胞外区片断的基因序列gDt,以pCEP4作为表达载体,构建N-末端带His标签的重组表达质粒pCEP4-gDt,转染至HEK293细胞进行表达。表达的蛋白采用镍离子柱亲和层析纯化,ELISA法检测目的蛋白的抗原性。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗血清,间接ELISA法检测效价。结果重组表达质粒经PCR、双酶切和DNA测序证实构建正确;表达产物经Western blot分析,在相对分子质量约46 000处可见目的蛋白条带;纯化的重组蛋白浓度约为45μg/ml,经ELISA检测证实具有良好的抗原性,免疫小鼠5周后,血清中特异性抗体效价达5×103。结论已在哺乳动物细胞中表达了HSV-2 gD胞外区片段,其具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV基因重组亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

不同类型消化液消化Vero细胞的比较

目的比较胰蛋白酶(胰酶)和TrypLE消化Vero细胞的效果,确定细胞工厂培养Vero细胞的最佳消化工艺。方法 10层细胞工厂中Vero细胞生长成致密单层后,分别用(37±1)℃预热的0. 25%胰酶和TrypLE及室温(18～26℃)的TrypLE进行消化,吸取消化后的细胞悬液进行细胞计数,并检测细胞活率。将消化后的细胞悬液接种至生物反应器中继续培养,检测葡萄糖代谢情况,并进行室温TrypLE消化细胞的重复性验证。结果用(37±1)℃0. 25%胰酶、TrypLE和室温TrypLE消化细胞所获得的平均细胞密度分别为1. 70×10~6、1. 68×10~6、1. 65×10~6个/m L,细胞活率均在95%以上。与0. 25%胰酶相比,使用TrypLE消化的细胞再培养时葡萄糖消耗量较高。10层工厂细胞消化所获细胞数的变异系数(CV)为2. 47%,消化传代后Vero细胞培养阶段葡萄糖代谢量的CV均小于10%。结论TrypLE作用温和,消化时细胞损伤较小,重复性好,细胞工厂规模化培养Vero细胞过程中可利用TrypLE替代胰酶进行细胞传代。     

聚乙二醇对非水解溶胶-凝胶法制备TiO2薄膜结构及性能的影响

采用非水解溶胶-凝胶法制备了多孔TiO2光催化薄膜.用紫外光照甲基橙的降解实验研究了聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)分子量和添加量对TiO2薄膜光催化活性的影响.应用场发射扫描电镜分析了薄膜的显微结构与其光催化性能的关系.结果表明:当PEG的相对分子量为1 000,PEG与TiCl4的摩尔比为0.1时,薄膜的比表面积大,薄膜颗粒细小,薄膜中存在均匀分布的大量微小孔隙,其光催化性能最佳.PEG的分子量和加入量过高或过低均会降低薄膜的光催化性能.当PEG的分子量过小或其加入量过少时,TiO2薄膜显微结构的特点是晶粒粗、孔隙数量多和孔径大.PEG的分子量过大或加入量过多,薄膜的颗粒细小,但前者导致薄膜致密而后者又促使薄膜多孔.     

胰高血糖素样肽-1的聚乙二醇定点修饰

采用分子量为5 kDa的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)修饰胰高血糖素样肽-1(GLP-1),建立了GLP-1的定点修饰反应及分离纯化工艺,考察了修饰反应各因素对单修饰产物得率及体外活性的影响,得到优化修饰条件为：pH 7.5, 50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液,GLP-1浓度1 mg/mL, PEG/GLP-1摩尔比2:1, 4℃下反应1 h. 在此条件下,单修饰PEG-GLP-1得率达50%. 反相高效液相色谱分离纯化所得单修饰产品纯度达98%,体外活性保留为未修饰GLP-1的86%,其在Sprague-Dawley远交群大鼠体内的循环半衰期为60 min,比原肽提高了20倍.     

克罗诺杆菌IbpA蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的表达并纯化克罗诺杆菌Ibp A蛋白,检测其免疫原性。方法提取克罗诺杆菌菌株CMCC45402的基因组,经PCR获得ibp A基因片段,连接至表达载体p ET30a(+),构建重组质粒p ET30a(+)-ibp A。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,用不同终浓度的IPTG(0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mmol/L)分别于30和37℃诱导表达不同时间(2.5、4、5 h),进行SDS-PAGE及Western blot分析。表达产物经Ni凝胶亲和层析纯化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,每2周加强免疫1次,共2次,末次免疫1周后,经小鼠眼球采血,分离血清,ELISA法检测血清效价。同时检测热激对Ibp A蛋白表达水平的影响。结果重组质粒p ET30a(+)-ibp A经双酶切鉴定证明构建正确。最佳IPTG诱导终浓度为0.2 mmol/L,最佳诱导温度为30℃,最佳诱导时间为5 h。诱导表达产物相对分子质量约24 000,主要以可溶性形式存在,可与抗His-Tag单克隆抗体特异性结合;纯化蛋白的纯度可达96%;小鼠免疫血清效价均可达1:25 000以上。用小鼠血清可检测到热激后克罗诺杆菌Ibp A的表达。结论本实验成功构建了ibp A基因的高效原核表达系统,获得了高纯度重组蛋白,制备了高效价抗血清,为后续ibp A基因和克罗诺杆菌热抗性关系的研究奠定了基础。     

流感病毒裂解工艺的优化

目的探讨影响流感病毒裂解的因素,优化流感病毒裂解工艺。方法分别在不同裂解时间(Triton X-100裂解1、2、3和4 h)、不同终浓度的裂解剂(终浓度为0.5%、0.6%、0.7%和0.8%的Triton X-100)、不同总蛋白浓度(2 000、3 000和4 000μg/ml)及不同的离子强度[终浓度为0.01、0.05、0.1和0.5 mol/L的PBS(p H 7.2)]下,对流感病毒进行裂解,电镜下观察病毒裂解效果,同时采用免疫单扩散法检测血凝素含量,Lowry法检测总蛋白含量,计算蛋白含量/血凝素含量比值(裂解后病毒纯度)及血凝素回收率,确定最佳裂解工艺参数。结果当裂解前病毒纯化液蛋白含量范围为2 000~3 000μg/ml,PBS终浓度为0.1 mol/L时,利用终浓度为0.7%~0.8%的Triton X-100裂解流感病毒2 h,可获得最佳裂解效果。结论确定了流感病毒最佳裂解参数,优化了流感病毒裂解疫苗生产中的裂解工艺。     

透明质酸的氧化降解及其体外免疫调节活性探究

通过抗坏血酸(Vc)、过氧化氢(H_2O_2)以及氯化铜(CuCl_2)氧化体系产生羟自由基(oOH),研究了该自由基对透明质酸(HA)的降解作用,得到低分子量透明质酸(LMWHA)。LMWHA经过乙醇沉淀和层析柱纯化后,通过高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测得其分子量为1.302×105Da。同时运用体外细胞实验探索了LMWHA的免疫调节活性,结果表明LMWHA具有增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性以及一氧化氮合酶(iNOS)活性,并提高一氧化氮(NO)的生成量,促进了脾脏T淋巴细胞的增殖,由此可见LMWHA能够调节小鼠的免疫功能。