pEGFP-C1-GnRH/TRS在HeLa细胞中的遗传稳定性

目的研究质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS在HeLa细胞中的遗传稳定性。方法取0代及传至第10、20、30和40代的工程细胞,在有选择压力(加G418)的条件下,测定pEGFP-C1-GnRH/TRS质粒丢失率。分别提取各代次工程细胞质粒DNA进行双酶切鉴定。将经酶切鉴定正确的第40代工程细胞质粒测序,并将各代次工程细胞加压筛选后,于荧光显微镜下观察。结果连续传10、20、30和40代后,质粒丢失率均不超过2%。不同代次的工程细胞质粒DNA经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切,酶切图谱相同。第40代质粒的GnRH/TRS序列与原代质粒相同。第40代细胞荧光分析与原代细胞相似。结论质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS在HeLa细胞中有较好的遗传稳定性。     

多拷贝GnRH类似物的原核表达及其纯化

目的原核表达促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,Gn RH)类似物,并进行纯化。方法人工合成8拷贝Gn RH类似物基因,并利用同尾酶技术构建16拷贝的Gn RH类似物基因,将8和16拷贝串联的Gn RH类似物基因分别克隆至p GEX-2t原核表达载体上,构建Gn RH类似物基因多拷贝串联表达的重组质粒,并转化大肠埃希菌BL21,利用优化后的IPTG诱导表达条件表达的重组Gn RH类似物蛋白经Glutathione Sepharose 4B柱纯化并酶解后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果质粒p GEX-2t-8Gn RH analogue和p GEX-2t-16Gn RH analogue经双酶切及测序证明构建正确。当IPTG终浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导2 h时,破菌后上清中目的蛋白表达量最高。表达的重组蛋白相对分子质量约37 000,可与兔抗Gn RH单克隆抗体特异性结合,纯化后的重组蛋白相对分子质量约1 400,蛋白浓度约260μg/ml。结论已成功构建Gn RH类似物多拷贝基因重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达,为多拷贝法生产生物活性小肽Gn RH类似物奠定了基础。     

LHRH受体在喉癌组织中的表达及其在喉癌HEp-2细胞膜表面与LHRH-PE40的亲和力

目的探讨人促黄体激素释放激素(luteinizing hormone releasing hormone,LHRH)受体在喉癌组织中的表达及其在喉癌HEp-2细胞膜表面与LHRH-PE40的亲和力。方法取外科手术收集的50份喉鳞癌及20份癌旁组织标本,采用Western blot法检测LHRH受体的表达,免疫荧光分析法检测LHRH受体的亚细胞定位,ELISA法检测HEp-2细胞膜表面LHRH受体与LHRH-PE40的亲和力。结果 LHRH受体在喉癌组织中的表达量明显高于癌旁组织(P0.001);LHRH受体在喉癌组织中定位于细胞膜和细胞质,而在癌旁组织中定位于整个腺体周边;LHRH受体在HEp-2细胞膜表面与LHRH-PE40的结合显示出线性和饱和性,且可被LHRH直接特异性抑制。结论 LHRH受体在喉癌组织中的过度表达及其在喉癌细胞表面与LHRH-PE40的高亲和力表明,其可能是LHRH-PE40的一个潜在的治疗靶点。     

提纯人绒毛促性腺激素的新途径

提出了提纯ＨＣＧ的新途径，人流物经４５％乙醇ｐＨ７．８抽提；７５％乙醇ｐＨ４．８二步沉淀；     

吸附无细胞百白破疫苗生产用菌株主要保护性抗原基因序列的遗传稳定性及理化性质的稳定性

目的对吸附无细胞百白破疫苗生产用菌株的主要保护性抗原基因序列遗传稳定性及理化性质稳定性进行研究,为无细胞百白破疫苗的安全性和有效性提供依据。方法分别从百日咳、白喉和破伤风疫苗生产用菌株的主代、工作代、疫苗生产用工作种子(P1)、P2、P3(P1后再传2代)的菌体全基因组DNA中,扩增出百日咳主要抗原组分[百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、外膜蛋白(pertactin,PRN)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)]、白喉主要抗原[白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)原液]、破伤风主要抗原[破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)原液]的基因序列,克隆至p LB-Simple Vector,转化E.coli DH5α,测序后,运用DNAMAN软件与Gen Bank中登录的相应序列进行比对和分析。按照《中国药典》三部(2015版)相关方法,进行菌株理化性质稳定性检测。结果生产用百日咳、白喉、破伤风菌株的主代、工作代、P1、P2、P3的主要抗原基因序列大小及同源性与预期一致,理化性质稳定。结论吸附无细胞百白破疫苗生产用菌株的主要保护性抗原基因序列遗传稳定,理化性质稳定。     

基因工程龋齿疫苗菌株的构建

采用PCR技术，扩增出两端分别增添了EcoR1和BamH1酶切位点的变链菌GTF基因，将其与高效表达的质粒PBV220载体连接后，克隆到大肠杆菌中，成功地构建出一株高效表达GTF基因的菌株。该菌株培养方法简便，GTF抗原表达量高，稳定性好，抗原主要存在于细胞内部，无包涵体形成，用所提的GTF抗原免疫家兔具有明显的免疫原性．是制备龋齿疫苗较为理想的工程菌株。     

卡介苗生产用菌株的遗传稳定性研究

目的观察我国生产用卡介苗上海D2PB302菌株(以下简称卡介苗上海D2株)的遗传稳定性。方法提取卡介苗上海D2株工作种子批4、7、10、13、15代单批培养物基因组DNA,以其为模板,PCR扩增16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因,并进行测序鉴定;对卡介苗上海D2株缺失区RD1、RD2、RD8、RD14、RD16及双组分系统操纵子SenX3-RegX3串联重复序列进行多重PCR检测;对卡介苗上海D2株缺失区RD1及Esat6基因进行多重PCR检测;并对基因座SenX3-RegX3进行序列分析。结果卡介苗上海D2株工作种子批4、7、10、13、15代单批培养物的16S rRNA序列均未发生变异,与GenBank中登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590.1)相似性为100%;卡介苗上海D2株工作种子批各代次特征性凝胶电泳图谱显示条带位置均相同,其基因座SenX3-RegX3有3个串联重复序列,每个串联重复序列均以ATG起始,TG结尾,且前后重叠连接在一起;卡介苗上海D2株工作种子批各代次中均缺少编码毒力的Esat6基因。结论卡介苗上海D2株与国际常用卡介菌亚株相比具有其特征性的遗传学特性,在传代15代次以内,分子遗传学特性稳定。在《中国药典》三部(2010版)规定的12代次内制备疫苗,卡介苗遗传特性一致。     

人GnRH及其转运肽基因合成及鉴定

目的人工合成人GnRH及转运肽(TRS)基因。方法根据已发表的人GnRH基因mRNA序列以及转运肽(9个左旋精氨酸)基因核苷酸序列,设计一对核苷酸,再用含7mol/L尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,然后以这对核苷酸3′末端短互补序列退火、补齐,合成长达90bp的目的序列GnRH/TRS。将其亚克隆到pMD18T载体上,构建重组质粒pYC1。酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC1,并测序。结果GnRH/TRS序列由90个核苷酸组成,扩增产物与原设计序列同源性达100%。结论已成功合成人GnRH/TRS基因,为进一步研究和应用奠定基础。     

KMB-17细胞株的遗传稳定性

目的研究连续传代的KMB-17细胞株的遗传稳定性。方法将第23代KMB-17细胞连续传代至60代,按常规染色体分析方法,观察不同代次细胞的染色体数目和结构变化。选取核基因组和线粒体基因组中高突变的15个STR位点,经PCR扩增和电泳分析微卫星不稳定性。结果KMB-17细胞株经连续传代培养至56代仍未发生染色体数目和结构改变,微卫星位点也未发生突变。结论KMB-17细胞株连续传代培养后,仍能保持细胞生物学特征及遗传特征的稳定,40代以前的细胞作为疫苗生产基质是安全的。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性

目的观察产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性。方法将含ETEC抗原成分热不稳定肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB)的双歧杆菌疫苗给SD大鼠灌胃4次,同时设对照组,以PBS平行灌胃。采用ELISA法检测大鼠粪便上清液IgA及血清IgG抗体水平;免疫组化法检测大鼠空肠中sIgA抗体的表达;肠绊试验检测肠毒素的活性。结果免疫疫苗的SD大鼠粪便上清液中产生了IgA抗体,血清中产生了特异性的IgG抗体,肠道内产生了特异性分泌型sIgA抗体;免疫组化结果显示,随着免疫次数的增加,抗体分泌量明显增加;双歧杆菌疫苗免疫的大鼠能够抵抗LT抗原的侵袭,而对照组大鼠则出现明显的肠道积液现象。结论构建的双歧杆菌疫苗具有良好的免疫效果,可保护SD大鼠免受ETEC的感染。     

重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌生物学特性的稳定性

目的观察重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌pKKH-BLyS/DH5α生物学特性的稳定性。方法工程菌连续传50代,每10代进行目的蛋白表达水平、质粒性状检测、透射电镜观察、革兰染色及各项生化检查,观察工程菌生物学特性的稳定性。结果0、10、20、30、40和50代工程菌之间目的蛋白的表达量无明显差异,基本维持在40%左右;双酶切、PCR及测序结果均与原代质粒相符;革兰染色均呈阴性;透射电镜观察及各项生化反应均呈现典型的大肠杆菌特性。结论该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种。     

表达MAGE-1/HSP70/MAGE-3工程菌的稳定性

目的检测重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状的稳定性。方法将工程菌菌株连续传50代,每隔10代挑取单克隆菌落进行诱导表达,并计算质粒丢失率。提取不同代次的质粒,扫描电镜观察,检测融合蛋白表达水平,并进行工程菌的染色镜检及生化鉴定。结果pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)融合蛋白工程菌呈典型的大肠杆菌形态,各代次菌的各项检测结果与原始菌种差异无显著意义。结论重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状稳定,可作为生产用菌种。     

重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件。方法控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响。结果发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%~50%。补料前比生长速率为0.5~0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1~0.2/h。连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L(A=52.6),质粒平均产量为359.8 mg/L。3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义。结论此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产。     

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。     

重组人干扰素α_(2b)工程菌的生物学特性检测

目的 观察和了解重组人干扰素α2b（以下简称rhIFN-α2b）工程菌的生物学性质,保证产品质量稳定。方法 通过对rhIFN-α2b工程菌的微生物学、分子生物学和免疫学检测,全面了解工程菌的性质。结果rhIFN-α2b工程菌呈现典型的大肠杆菌形态,在甘油中可以贮存1年,在冻干条件下可以保存2年,其生物学特性比较稳定。结论 rhIFN-α2b工程菌生物学特性稳定不变。     

大肠杆菌重组人成骨蛋白-1的非诱导表达特性

目的　研究大肠杆菌重组人成骨蛋白 1的非诱导表达特性。方法　通过水质、起始pH、接种量、葡萄糖添加量、甘油添加量、装液量、转速等实验研究不同营养条件和培养条件对OP 1非诱导表达的影响。通过传代实验 ,考察该系统OP 1表达的稳定性。结果　水质对OP 1的表达没有明显影响 ,2 %～ 4 %的接种量有利于OP 1的表达 ,起始pH以 6 0为宜。葡萄糖对OP 1的表达有较大影响 ,2 %～ 4 %的葡萄糖添加量可以获得较高表达。甘油的添加能明显促进OP 1的表达 ,最适添加量为 0 3% ,较对照提高表达 81 7%。该表达系统对溶氧的需求不大 ,装液量和转速分别以 12 5～ 15 0ml和 15 0r min为宜。在优化条件下 ,最适表达时间为 2 4～ 2 6h ,OP 1的表达量可达到菌体蛋白的 4 0 %。优化的营养条件和培养条件对本系统OP 1的表达和质粒的稳定有利 ,10次传代可保持 90 %表达。结论　建立了非诱导表达的摇瓶发酵工艺 ,对其非诱导表达特性有了较为深入的了解 ,为进一步放大研究奠定了基础。     

大肠杆菌E.coli HB101(pBR322) 高密度培养过程质粒的稳定性

通过正交实验考察了大肠杆菌E.coli HB101(pBR322)高密度培养过程中,不同培养条件对质粒的稳定性和β-内酰胺酶活力的影响. 结果表明,当温度在33~39℃、pH为6.4~7.2、DO为 40%~80%、 补料速率在5.4~10.8 g/h范围内变化,以及细胞密度达到27.3 g/L、比生长速率达到0.73 h-1时,质粒没有发生丢失现象,但在培养过程中β-内酰胺酶的活力降低.