鳗弧菌胞外产物中致病因子的分离纯化及性质研究

鳗弧菌致病株M3的胞外产物经超滤、Sephadex G100凝胶层析、DEAE－cellulose离子交换层析和HPLC凝胶色谱层析纯化后，得到一个纯化的毒性蛋白酶，其对金鱼的半数致死量为1.2微克蛋白／克体重。该蛋白酶的分子量为36.5kDa，等电点为5.1；与底物Azocasin作用的最适pH为8.0，最适作用温度55℃,85℃作用30min后酶被灭活。该酶活性可被EDTA、EGTA及1，10－菲咯啉抑制，表明它是金属蛋白酶。N端部分氨基酸序列经测定为AGATGTGPGGAGLTG。     

大菱鲆免疫球蛋白M(IgM)单克隆抗体的制备与特性鉴定

应用细胞工程技术研制大菱鲆免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)的单克隆抗体并分析其免疫学特性。小鼠骨髓瘤细胞NS0与经IgM免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合,经过反复有限稀释法克隆,筛选获得4株抗大菱鲆IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为B1D1、D5C2、E1B2和F4A1。经小鼠腹水扩大生产后,单抗效价为1∶1.024×106检测灵敏度为32 ng/mL。Western blot分析表明,获得的单抗与IgM重链区特异性结合。交叉结果显示,单抗与大菱鲆血清呈强阳性反应,与褐牙鲆、红鳍东方鲀、许氏平鲉、六线鱼、鲈鱼均呈微弱阳性反应,而与半滑舌鳎、鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鳙鱼的血清无交叉反应。本研究制备的大菱鲆IgM单克隆抗体效价高、灵敏度高、特异性强,适合用于大菱鲆免疫学相关研究和生产实际应用。     

中国明对虾乙酰基专一性凝集素分离纯化方法的研究

为研究凝集素在中国明对虾天然免疫中的作用,利用3种不同物质--N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、胎球蛋白(Fetuin)和小牛黏液素(BSM)为配基,分别与3种柱材料结合进行亲和层析,从中国明对虾血淋巴中纯化凝集素.这3种亲和层析均得到了一种相同的凝集素FCL-1,经SDS-PAGE证明FCL-1的分子量为168kDa.利用新鲜小鼠血细胞进行分离纯化同样获得了这种凝集素.FCL-1与乙酰基糖类和唾液酸类糖蛋白均具有较强的结合特性.     

聚合物辅助超滤技术处理含铈废水

使用聚乙烯亚胺(PEI)辅助超滤法处理放射性废水中的铈(Ce).着重研究了pH,聚合物/金属离子质量比(P/M),离子浓度以及操作压力、运行时间对铈离子(Ce3+)截留率和膜渗透通量的影响.研究结果显示:使用聚合物PEI辅助超滤时,最佳实验条件为pH=5,P/M=15;在最适pH和P/M比值下,3种截留分子量超滤膜对Ce3+截留率分别为88.23%(5kDa)、87.01%(10kDa)和89.78%(30kDa);当溶液中存在Na+和Ca2+时,膜对Ce3+的截留率将会降低.膜通量随着操作压力的增加呈线性增加;3种膜通量均随着运行时间的增加有减小的趋势,且下降率顺序为30kDa10kDa5kDa.     

PD-1单抗规范化治疗30例恶性肿瘤的有效性及安全性观察

目的:分析PD-1单抗规范化治疗恶性肿瘤患者的疗效及其安全性。方法:选择30例于2020年1月至2020年12月期间到我院就诊的恶性肿瘤患者,对其临床资料进行回顾性分析,所有患者经靶向药物规范化治疗或化疗后病情未得到控制,均予以PD-1单抗(信迪利单抗)规范化治疗,评价患者近期的疗效以及毒副反应发生情况。结果:全组不良反应发生率为22例(73.33%),主要为疲乏5例(22.73%)、发热4例(18.18%)、免疫相关性肺炎3例(13.64%),其次为甲状腺功能减退4例(18.18%)、皮疹3例(13.64%)、腹泻2例(9.09%)、甲状腺功能亢进2例(9.09%)。结论:采用信迪利单抗规范化治疗恶性肿瘤患者其疗效较好,患者病情可以得到有效控制,经规范化治疗后不良反应发生的情况均为可耐受,安全性较高,对患者的预后有积极影响,建议在临床中加以推广。     

真鲷(Pagrosomus major)卵黄原蛋白的分离纯化及抗血清制备

采用分子筛和离子交换两步层析法分离纯化了真鲷(Pagrosomus major)的卵黄原蛋白(VTG),并采用非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了真鲷VTG的分子量,发现真鲷VTG在非变性条件下的分子量大约为450kDa;在SDS变性条件下,两条亚基的分子量大约分别为170kDa和120kDa。Western-blot检测结果表明这两条亚基都能够与真鲷VTG多克隆抗血清产生免疫反应,而真鲷VTG的170kDa亚基是检测真鲷VTG的特异性条带,且最低检出浓度为0.1μg L~(-1)。鼠抗真鲷VTG多克隆抗血清对真鲷VTG具有良好的特异性,这一结果为采用真鲷为模式生物检测海洋环境雌激素奠定了实验基础。     

双硫酯为链转移剂的活性自由基水相聚合

在通常的自由基乳液聚合体系中加入双硫酯链转移剂PhC(S)SCH(CH3)Ph，研究了3种酯类单体的活性自由基水相聚合。发现在引发剂与链转移剂的摩尔比为1：3．3－1：4时，可得到多分散性系数小（＜1．3），实测分子量与理论分子量相近的聚甲基丙烯酸丁酯（PBMA）、聚丙烯酸丁酯（PBA）等聚合物；聚合物的分子量随时间和转化率的增加而增加，具有活性聚合特征；醋酸乙烯酯的聚合未得到理想产物。以偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂时，合适乳化剂为OP－8（占单体量10％）；以（NH4）2S2O8引发时，合适乳化剂是十二烷基磺酸钠（占单体量2．4％）与聚乙烯醇（PVA，占单体量1％）的混合乳化体系。油溶性引发剂AIBN具有较好的控制聚合效果。     

中国对虾血细胞单克隆抗体研制及对虾血细胞类型的鉴别

选用聚乙二醇（PEG）作为细胞融合剂,将免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与P3－X63－Ag8U1骨髓瘤细胞融合,制备产生抗中国对虾血细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞。运用酶联免疫吸附测定（ELISA）和间接免疫荧光抗体技术（IIFA）进行了杂交酶细胞的筛选,最后建立了分泌抗中国对虾血细胞单抗的23株杂交瘤细胞。其中以3A3、3B3和3B6为代表的三组单抗能够鉴别中国对虾对虾的三类血细胞亚群。这为今后进一步研究中国对虾血细胞不同亚群的免疫特性提供了有利手段。     

基于凝胶渗透色谱分析的天然沥青高温性能机理

为明确理解天然沥青改性沥青分子量分布特征与沥青宏观技术性能之间的联系,采用凝胶色谱方法分析不同掺量天然沥青改性沥青的重均分子量、数均分子量、峰值分子量和分散系数等分子量分布特征。开展室内针入度、软化点,粘度和旋转薄膜烘箱老化等实验评价天然沥青改性沥青的路用性能特性。实验结果表明,天然沥青的掺入使改性沥青的分子量在较小分子量M1 000范围内减小;在中等分子量范围内(1 000~6 000)增加明显。重均分子量与M4 000的小分子量组分含量与针入度、软化点和粘度具有良好的线性关系。随着天然沥青掺量的增加,改性沥青的重均分子量和数均分子量逐渐增大,宏观上体现为沥青的高温稳定性得到改善。     

聚羧酸超塑化剂/膜分离组分与水泥或复合胶凝材料体系的相容性研究

采用超滤膜法将自制聚羧酸超塑化剂PC0(重均分子量为107900 Da)分离成4种不同分子量范围的分离组分(F1、F2、F3、F4),重均分子量分别为215700Da、79160 Da、28570 Da、3751Da.通过净浆流动度表征了该聚羧酸超塑化剂/分离组分与胶凝材料体系的相容性.研究结果表明,自制聚羧酸超塑化剂及各分离组分对同种水泥的相容性优劣顺序均为:F2＞F1＞PC0＞F3＞F4;重均分子量为79160 Da的F2对3种水泥浆体均有较优的分散性,重均分子量为3751Da的F4对水泥浆体无分散性.对聚羧酸超塑化剂及其分离液与不同矿物掺合料复合浆体的相容性进行比较,得出:聚羧酸超塑化剂/分离液与单掺粉煤灰、矿粉、硅灰的复合胶凝材料体系的相容性顺序分别为F2＞PC0＞F1＞F3;F2＞PC0＞F1＞F3;F2＞PC0＞F1(F3对掺加硅灰的复合浆体无分散性).     

致病性鳗弧菌金属蛋白酶基因克隆及序列分析

从我国山东沿海发病的鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到一株致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）W-1，该菌的胞外蛋白酶活性为4226u/ml，部分纯化的胞外蛋白酶对海水养殖大菱鲆鱼有一定的毒性。应用PCR扩增，从鳗弧菌W-1染色体DNA扩增出一条长约1.925kb的特异性PCR产物，DNA序列分析表明：克隆的片段含有完整的金属蛋白酶基因阅读框，编码611个氨基酸残基的蛋白质，该金属蛋白酶基因与一株致病性鳗弧菌蛋白酶基因的核苷酸及氨基酸序列同源性为100%，而与解蛋白弧菌（V.proteolyticus)、创作弧菌（V.vulnificus）、霍乱弧菌（V.cholerae)、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的氨基酸序列同源性分别为73%、70%、69%、53%、51%。     

鳗弧菌溶血素基因的克隆及突变株的构建

PCR扩增出鳗弧菌M3溶血素基因的保守区序列,根据保守区序列设计引物,利用反向PCR和巢式PCR扩增出溶血素基因的部分序列,结合构建的鳗弧菌M3的基因组文库,克隆出溶血素基因的全长序列。根据基因推测的氨基酸编码序列与已发表的血清型为A的鳗弧菌PT84057有86％的相似性。用自杀质粒对鳗弧菌M3染色体上的溶血素基因进行了插入突变,将突变株对金鱼进行肌肉注射,结果发现,突变株的毒力没有发生显著的变化,证明所克隆的溶血素基因对鳗弧菌M3的毒力没有直接的贡献。     

从鳗弧菌M3 Fosmid文库筛选aroA基因

为克隆鳗弧菌aroA基因 (它在细菌中编码合成芳香族氨基酸的关键酶--5-烯醇氏丙酮酰莽草酸3-磷酸(EPSP)合成酶),在实验室中构建了鳗弧菌M3大分子量基因组Fosmid文库,并通过克隆测序获得了部分序列,以此为基础,通过延伸测序获得了ar oA基因序列全长. 该基因全长1281bp,编码427个氨基酸,包含一个11个氨基酸残基的信号肽;编码区GC平均含量为46.8%,推测分子量为46177 Da.相似性分析表明,鳗弧菌的aroA核苷酸和氨基酸序列与其他弧菌的相似性最高,分别在73%～75%和78%～82%;进化树结果也表明鳗弧菌ar oA与其他弧菌的亲缘关系最近.aroA基因的克隆为构建鳗弧菌弱毒疫苗奠定了基础.     

应用间接ELISA技术快速检测花鲈病原菌-鳗弧菌

以花鲈（Lateolabrax japonicus)弧菌病的病原菌－鳗弧菌（Vibrio auguillarum)W-1为抗原,制备兔抗血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清（HRP－IgG)为酶标二抗,建立了检测鳗弧菌的间接ELISA快速检测法。结果表明,应用间接ELISA技术检测鳗弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为10^5个／ml,即10^4个／孔。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。对46份人工感染后的花鲈组织样品,包括肌肉、鳃、肠、肝、肾等组织的检测表明,阳性检测率为76．1％。     

鲆鲽类主要病原菌抗血清的制备及应用

用甲醛灭活8种鲆鲽类主要病原菌,鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri),制备成灭活疫苗后肌肉注射大菱鲆获得各病原菌抗血清。结果显示,抗鳗弧菌血清、抗哈维弧菌血清、抗豚鼠气单胞菌血清、抗鮰爱德华菌效价为1:6 400,抗创伤弧菌血清、抗溶藻弧菌血清、抗嗜水气单胞菌血清效价为1:12 800,抗迟缓爱德华菌血清效价为1:102 400。应用ELISA分析各抗血清与8种病原菌及迟缓爱德华菌蛋白的免疫交叉反应,结果显示,各病原菌与其本身的抗血清反应最为强烈,而与其他抗血清间有程度不等的交叉反应;菌蛋白与其相应的菌抗血清反应最为强烈,与其他病原菌抗血清反应较弱。本研究所制备的病原菌抗血清效价较高,且具有特异性,可应用于鲆鲽类病原菌的检测。     

海洋有益菌的筛选与鉴定

从健康的斑节对虾（Penaeus monodon）幼体及其养殖环境中分离到213株海洋细菌,采用十字叉划线法和琼脂扩散法进行体外拮抗试验,从中筛选到5株对水产养殖动物病原哈维氏弧菌（Vibro harueyi）和鳗弧菌（Vibrio anguillarum）等菌株生长有抑制作用的海洋细菌。根据其形态特征以及生理生化反应特征,初步鉴定为交替单胞菌属（Alteromonas）,其中菌株A18鉴定为橙色交替单胞菌（Alteromonas aurantia）。     

鳗弧菌pEIB1质粒缺失株MVAV6201的筛选和三价铁源供给的优化

以鳗弧菌Vibrio anguiUarum MVM425(01型)为出发菌株,通过变温培养诱变筛选得到pEIB1质粒缺失株MVAV6201。通过与野生株MVM425的摇瓶培养对比发现,Fe^3 营养的摄取是质粒缺失株MVAV6201生长的瓶颈。MVAV6201对Fe^3 的吸收有赖于外界Fe^3 营养的供给形式。柠檬酸铁铵能有效增强MVAV6201对三价铁营养的吸收,促进菌体细胞的生长。柠檬酸铁铵饱和浓度为0．4mmol／L。     

一株牙Ping出血症病原菌的分子生物学鉴定

从患出血症养殖牙Ping分离到一株病原菌M4,革兰氏阴性,杆状,有极生和侧生鞭毛,能运动,菌落半透明。进行了常规生理生化和BIOLOG－GN细菌鉴定系统测试。结果表明菌株M4与V.carchariae的表型特征非常相似。为了进一步确定M4的分类学地位,测定了其16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树,结果表明菌株M4和V.carchariae的亲缘关系最近。综合上述结果,菌株M4可鉴定为Vibiro carchariae。     

基体铝合金成分对无压浸渗B4C/Al复合材料微观组织和力学性能的影响

分别选用2024、5056、6061和7075铝合金,采用颗粒级配相同的碳化硼预制体(20%2μm和80%38μm)为增强体,采用无压浸渗法制备4种高体份B4C/Al复合材料(分别对应标记为2M、5M、6M和7M),研究基体合金成分对复合材料的物相组成、微观组织和力学性能的影响。结果表明,4种复合材料均含有A1、B4C、Al3BC、AlB2和富Fe-Mn相,除此之外,2M、5M和7M复合材料还含有Al B10。4种复合材料小颗粒碳化硼聚集区均发生了剧烈的界面反应,生成Al3BC和Al B2。Al B10主要分布于2M、5M和7M复合材料的大颗粒碳化硼周围,并与大颗粒碳化硼连成一体。4种复合材料的洛氏硬度从大到小顺序为2M(45. 7)、7M(43. 1)、5M(41. 8)和6M(40. 02)。2M、5M和7M复合材料内部发现有孔洞存在,导致复合材料弯曲强度和应力均较低。这种效应在7M复合材料中最为明显,其弯曲强度仅为296 MPa。6M复合材料弯曲强度和应变最高,分别为425 MPa和0. 183%,这主要是因为在6M复合材料中,不含Al B10相且残余铝合金相对含量较高。