PCR快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法研究

为了满足食品卫生快速反应体系的需要,提高水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的检测效率,本实验针对副溶血性弧菌特异性tl基因设计合成引物,采用酚-氯仿法提取DNA,利用大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)做方法特异性对照,建立了水产品中副溶血弧菌PCR快速检测方法。利用此方法对市场随机抽取的40份水产品进行检测,并用国家标准方法(GB/T4789.7—2003)对该方法的检验结果进行评价。结果表明:该方法操作简便,特异性强,菌液灵敏度为103CFU/ml,含菌量1～10CFU/g的样品经增菌6h后即可检出。与国标方法相比更加准确可靠,检测周期10h即可完成。说明此方法适合水产品中副溶血性弧菌的快速检测。     

水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

水产品中副溶血性弧菌快速检测技术研究进展

副溶血性弧菌广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼虾、贝类等海产品中,是一种重要的食源性致病菌。在我国沿海地区,由副溶血性弧菌引发的食品安全事件数量已经跃升食品中毒事件的首位。因此,为了提高水产品中副溶血性弧菌的检出准确率,降低食物中毒的风险,有必要建立快速、准确、灵敏的检测副溶血性弧菌的方法。目前,除了传统的检测方法外,分子生物学和免疫学等快速检测方法已成为副溶血性弧菌的主流检测技术。本文主要综述了分子生物学和免疫学快速检测方法在副溶血性弧菌检测中的应用现状,并对未来的发展前景作了展望。     

冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测方法研究

文章研发了一种可在16 h内完成冷冻水产品中副溶血性弧菌快速检测的方法。方法在首先完成样品的预增菌工作后,采用高温热裂解法与核酸亲和膜吸附法提取冷冻水产品等样品中的检材总DNA,设计副溶血性弧菌专一引物探针,运用实时荧光定量PCR技术扩增试样中副溶血性弧菌基因组保守基因片段,同时开展与国家标准方法的比对工作证实方法的可靠性,建立了特异性好、高检测通量的PCR检测方法。为验证所建立方法的适用性与稳定性,本研究从市场中随机抽取共331份冷冻水产品样品开展副溶血性弧菌的筛查检测,结果表明采用该方法在上述抽样调查的冷冻水产品中3份样品的副溶血性弧菌特异性的基因片段被扩增检验出,试样的目标菌检出率约为0.9%(3/331),该研究PCR方法的DNA检出限可达到0.01 ng/μL。     

水产品中副溶血性弧菌致病性和检测方法研究进展

副溶血性弧菌（VP）是一种常见的食源性致病微生物,主要存在于近岸海水、海底沉积物和鱼、虾以及贝类等海洋生物中。人类食用了含有该菌的生的或者未煮熟的水产品可能引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病。本文对副溶血性弧菌的生物学特性、致病性特点等进行了综述,重点介绍了检测方法。     

ELISA法快速检测水产品中副溶血性弧菌

以副熔血性弧菌抗原免疫新西兰大白兔获得特异性抗体,利用此抗体,进行间接竞争ELISA法实验,确定了抗原抗体最佳反应浓度和一抗稀释度分别为107cfu/mL和1:4000,酶标二抗IgG-HRP最佳工作稀释度为1:1000.以此方法分别对人工染菌水产品及实际水产品进行检测,检测下限为104cfu/mL,检测时间为8h;而经8h增菌后,其检测下限为103cfu/mL.此法与常规方法检测结果完全一致,具有很高的实际应用价值.     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

食品中副溶血性弧菌PCR快速检测方法的研究

为建立食品中副溶血性弧菌 (VP)的PCR检测方法 ,选取tl基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 14株从国内食品中分离的副溶血性弧菌 (经传统方法验证 )和 30株非副溶血性弧菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测。扩增片段表现出极好的特异性 ,对人工污染的冷冻虾仁、沙丁鱼的检出限为 10CFU g ,且与传统方法结果吻合。该方法适宜于食品中副溶血性弧菌的检测。     

水产品中副溶血性弧菌PMA-ddPCR活菌定量检测方法的研究

本研究旨在针对水产品中活的副溶血性弧菌建立一种快速定量的PCR检测方法。基于叠氮溴化丙锭(PMA)在一定光照条件下能抑制死亡菌DNA扩增,以及微滴式数字PCR技术能将检测精度扩展至单分子目标基因,并实现绝对定量的特点,以副溶血性弧菌tlh基因为目的片段设计及筛选适合的特异性引物与探针,优化反应体系,通过对PMA浓度及曝光条件等优化,建立了一种联用PMA-dd PCR技术快速检测水产品中活的副溶血性弧菌的定量检测方法。研究结果显示:选择16μg/m L作为PMA工作浓度,曝光时间为8 min,此条件下能够完全抑制副溶血性弧菌死菌的DNA扩增并对活菌扩增无影响。通过对比PMA-dd PCR和PMA-q PCR的检测低限分别为2×10~1 cfu/mL、2×10~2 cfu/mL,PMA-dd PCR法的灵敏度比PMA-q PCR法的高。应用PMA-dd PCR定量方法检测人工污染的基围虾和小帆立贝这两种海产品,在基围虾中最低可检出1.9×10~1 cfu/g的副溶血性弧菌、在小帆立贝中最低可检出8.9 cfu/g的副溶血性弧菌。该研究为将PCR技术实际应用于水产品中低量污染、活的副溶血性弧菌的定量检测奠定了基础。     

水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化

本文用副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因作靶标,优化环介导等温扩增技术检测水产品副溶血性弧菌的方法。体系用Bst DNA聚合酶催化,恒温反应60 min,产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定,对各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP和PCR反应,比较二者的敏感度;对32株食源性病原菌（包括分离于水产品的25株副溶血弧菌,1株副溶血性弧菌ATCC17802标准株,大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B4、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门氏菌50041各1株）进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP的可靠性。各参数最佳条件为：Mg2+浓度为3.6 mmol/L,dNTPs浓度为0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为4.8 U,内外引物浓度比为8:1,最佳反应温度为63 ℃,时间为60 min;LAMP的检测限为1 CFU/mL,低于PCR方法的最低检测限;特异性试验检测26株副溶血性弧菌均为阳性,6株非副溶血性弧菌为阴性;人工污染试验中检测限达1 CFU/mL,无假阳性。建立的LAMP方法操作简单且灵敏度高,适用于水产食品中副溶血弧菌的现场快速检测。     

重组酶介导扩增技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

目的 建立重组酶介导扩增技术（RAA）快速检测副溶血性弧菌的方法。方法 本研究根据副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus）tlh 基因序列设计特异性引物,经引物筛选,建立副溶血性弧菌的重组酶等温扩增（recombinase aidamplification, RAA）的快速检测方法。结果 该方法在25 ℃-43 ℃条件下,30 min即可观察到检测结果。特异性试验结果表明RAA方法检测副溶血性弧菌与其他弧菌属菌种不存在交叉反应,灵敏度试验分析结果表明RAA方法检测副溶血性弧菌检出限为5.3×101 CFU/mL。用100份样品验证RAA方法的可靠性,结果显示RAA方法和传统划线方法结果符合率为100%,表现出高度一致性。结论 本研究建立的RAA检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速等优点,为水产品中副溶血性弧菌的检测提供了新的发展方向。     

副溶血性弧菌和溶藻弧菌的双重PCR检测技术

主要针对副溶血性弧菌(Vp BJ1997)和溶藻弧菌(Va ATCC17749)的gyrB基因的不同位点设计特异性引物,利用双重PCR技术同时检测Vp(BJ1997)和Va(ATCC17749),并对该反应体系的特异性以及灵敏度进行检测。结果显示Vp(BJ1997)灵敏度的检测下限可达2×10~2CFU/mL,Va(ATCC17749)灵敏度的检测下限可达2.03×10~2CFU/mL,双重PCR与单一PCR检测的灵敏度的数量级是相同的;与沙门氏菌(ATCC27892)、金黄色葡萄球菌(ATCC13565)、大肠杆菌(35218)、河弧菌(H265)、鳗弧菌(M936)、创伤弧菌(ATCC27562)无交叉反应;在人工污染试验中,混合菌液的检测下限2.84×10~3CFU/mL,而进一步稀释至2.84×10~2CFU/mL时,Vp(BJ1997)已检测不出,Va(ATCC17749)仍可检出。研究表明,该方法特异性强,灵敏度高,操作简单,成本低,检测速度快,为基层单位同时检测副溶血性弧菌和溶藻弧菌提供了一种快速准确的方法,对控制水产品中这两种致病性弧菌具有重大的意义。     

生食动物性水产品中副溶血性弧菌和创伤弧菌污染状况分析

目的 了解生食动物性水产品中副溶血性弧菌和创伤弧菌污染状况。方法 采用随机抽样方法,在我国13个地区的餐饮店、零售店和批发市场采集生食动物性水产品,共计2 980份,对样品进行副溶血性弧菌和创伤弧菌检测。结果 生食动物性水产品中副溶血性弧菌检出率为14.7%(437/2 980),污染水平＞100 MPN/g的样品比例为2.9%(83/2 909);创伤弧菌检出率为3.5%(104/2 980)。采样于批发市场的样品中副溶血性弧菌检出率、污染水平＞100 MPN/g的样品比例和创伤弧菌检出率均高于餐饮店和零售店。第三季度副溶血性弧菌检出率、污染水平＞100 MPN/g的样品比例和创伤弧菌检出率最高。造成污染的主要原因包括原产地污染,储存不当及加工过程交叉污染。结论 生食动物性水产品中存在副溶血性弧菌和创伤弧菌的污染,其健康风险应引起关注,本次污染状况分析可为标准制修订提供理论依据。     

利用sQMRA软件开展广州市水产品副溶血性弧菌快速定量风险评估

目的 评估广州水产品副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)人群致病风险.方法 对2006—2018年广州市售鱼类、甲壳类、软体动物等水产品中的VP进行定量检测,利用广州市食物消费量调查、文献综述等方法,应用快速微生物定量风险评估软件(swift quantitative microbiol...     

海产品中副溶血弧菌的分离和PCR检测

为了建立一种快速、特异的PCR方法检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp),根据Genebank库中收录的Vp的tlh基因序列进行引物设计,应用PCR技术扩增tlh基因。利用TCBS和TSI2种选择性培养基从海产品总分离出68株疑似副溶血弧菌,经生化鉴定68株均为副溶血弧菌。用Chelex100法提取基因组DNA,进行tlh基因的PCR检测,tlh基因在不同副溶血弧菌中都广泛存在,而大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等其他食源性致病菌均为阴性。tlh基因具有种属特异性,因此可以用来检测副溶血弧菌。     

海产品中副溶血性弧菌检测能力验证分析报告

目的通过参加英国FAPAS分析实验室组织的海产品中副溶血性弧菌检测能力验证,对其实验结果出现的异常现象进行分析,找出导致本次能力验证组织失效的原因。方法按照GB 4789.7-2013、SN/T1870-2016及相关作业指导书等进行实验,通过采用本实验室经常采用的检测方法进行检验,对实验出现的异常结果进行分析。结果发现M224d21A和M224d21B这2个冷藏运输箱包装的冻干样品由于储藏和运输等问题,导致未检出副溶血性弧菌。结论此次能力验证分析对于我院在海产品中副溶血性弧菌检测方面技术水平的提高和品牌形象的确立起到了积极作用,同时也为检验工作者对于能力验证出现异常现象提供一种解决问题的新思路、新方法。     

水产品副溶血性弧菌污染监测结果的比较分析

摘 要：目的 了解我国水产品副溶血性弧菌污染情况,找出风险监测及预防副溶血性弧菌食物中毒重点区域。方法 以广州市往年监测数据为基础,结合文献公布的其他区域中水产品副溶血性弧菌污染监测结果,进行综合分析,得出结论。结果 2124份水产品样品进行副溶血性弧菌检测, 检出451份,检出率为21.23%。广东、江苏、浙江等沿海地区检出率高于内地监测结果,广东地区检出率高于江浙地区,广东地区淡水鱼副溶血性弧菌检出率高于内地水产品检出率(χ2=4.845,P < 0.05)。结论 广东地区为国内水产品副溶血性弧菌污染最严重的地区,其次为江浙地区,两地检出率均远高于内地,表明国内水产品副溶血性弧菌风险监测重点区域为广东及江浙等沿海地区。