利用F0F1-ATPase分子马达生物传感器检测食品中的副溶血性弧菌

利用载色体上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器对副溶血性弧菌检测快速检测。在ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体-生物素-链霉亲和素-生物素-toxR探针,将待测副溶血性弧菌标准菌株和阴性对照分别与生物传感器结合后,比较其催化ATP合成30min后的ATP产生量,可以对副溶血性弧菌的DNA进行检测。ATP合成的多寡可以通过环境中H+的量进行测量,而H+的多寡通过F-DHPE所体现的荧光强度大小来获得。结果表明,chro toxR的质量浓度在0.156mg/mL,副溶血性弧菌DNA质量浓度在40ng/mL时为最适检出条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及聚合酶链式反应检测方法对照,具有良好的符合性。     

利用F_0F_1-ATPase分子马达技术检测志贺氏菌

利用载色体chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器,建立应用在食品检测中快速检测方法。首先从嗜热菌中提取载色体,合成生物素化宋内氏志贺氏菌IpaH探针,在载色体ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体-生物素-链霉亲和素-生物素-IpaH探针,将待测宋内氏志贺氏菌标准菌株和阴性对照分别与此生物传感器结合,比较其催化ATP合成10 min后的ATP产生量,进而对宋内氏志贺氏菌DNA进行检测。ATP合成的量可以通过luciferase-luciferin检测试剂所体现的荧光强度大小标定。结果表明,chroIpaH(连接在载色体chro上的IpaH探针)的浓度在0.031 mg/mL,宋内氏志贺氏菌DNA浓度在50 ng/mL为最适检测条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及PCR检测方法对照,具有良好的检测符合性。     

分子马达传感器对沙门氏菌快速检测方法的初步研究

利用F0F1-ATP合酶的旋转特性及对H+敏感的荧光物质F-DHPE作为指示剂来检测样本中有无目标物。通过生物素-亲和素系统将特异性invA核酸探针连接在F0F1-ATPase的ε亚基上构建生物传感器;将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后,比较其催化ATP合成30min后的ATP产生量,依此对样品中的沙门氏菌DNA进行检测。结果表明,该方法对沙门氏菌DNA的检测时间为1h,检出限为10ng/mL。从食品样本分离得到的30株细菌,利用分子马达生物传感器的检测结果与PCR检测的结果一致。     

纳米生物传感器在氯霉素检测中的应用

利用pH 敏感的荧光指示剂F1300 可以量化ATP 合酶活性的特点,构建生物传感器,开发灵敏、特异、快速的氯霉素残留检测方法。将pH 变化敏感荧光物质F1300 标记到色素体(chromatophore)的内表面,然后,将β亚基抗体- 生物素- 链亲和素- 生物素- 氯霉素抗体系统连接到色素体上F0F1-ATPase 的β亚基上,该检测体系能与氯霉素相连接。采用微弱发光检测仪检测荧光值,根据荧光值确定氯霉素浓度。样品中氯霉素浓度越高表现出的总荧光值越低,反之亦然。该方法的检测限为1 × 10 － 11mg/mL,且检测操作仅需35min,能快速、高灵敏地检测氯霉素,具有很好的应用前景。     

F_0F_1-ATPase生物传感器检测食品中食源性诺如病毒

应用分子马达生物传感技术,建立食品中诺如病毒特异性快速检测方法。以嗜热菌中提取的载色体(chromatophore)为材料,根据诺如病毒ORF1和ORF2连接处的高度保守区设计探针,利用生物素-亲和素系统将诺如病毒探针连接在F0F1-ATPase的ε亚基上构建生物传感器。提取病毒RNA并将其与生物传感器结合的同时启动ATP合成,比较其荧光强度的差别,对样品中的RNA进行检测。建立并优化了F0F1-ATPase生物传感技术检测食源性诺如病毒的方法。所建立的方法具有良好的特异性,12个含诺如病毒样品均能检出,3个不含诺如病毒样品均未检出,无假阴性或假阳性情况出现。该方法可在1 h内完成检测,检测灵敏度在RNA水平上达到0.005 ng/m L。所建立的分子马达生物传感技术可以较好的检测食品中的诺如病毒,并为其他病毒的检测提供参考。     

用免疫生物传感器快速检测金黄色葡萄球菌的初步研究

目的研究快速、经济、高灵敏的金黄色葡萄球菌新型检测技术。方法本研究应用F0F1-ATP酶旋转分子马达和免疫技术相结合,建立金黄色葡萄球菌的免疫生物传感器快速检测技术。首先pH变化敏感的荧光物质F1300标记到F0F1-ATP酶的载体色素体的内表面,然后在F0F1-ATP酶上连接β亚基抗体-生物素-链亲和素-生物素-金葡菌抗体复合体,得到可以捕获金黄色葡萄球菌的免疫生物传感器。传感器上负载菌量不同,引起的酶活性变化不同,酶活性变化又引起色素体内pH变化,最后通过F1300的荧光强度变化来检测菌量。结果该方法对金黄色葡萄球菌标准菌株(CMCC26003)的检测时间为4.5h,102～104CFU/孔呈现良好的梯度关系。结论该技术耗时短、操作简单、成本低、灵敏度高,符合食品安全检测技术发展要求。     

基于生物条形码探针和金纳米颗粒的大肠杆菌O157:H7检测

建立一种基于生物条形码探针和金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)对致病性大肠杆菌O157:H7检测的新方法。用生物功能化的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)和AuNPs与目标物大肠杆菌O157:H7进行免疫反应,形成MNPs/目标物/AuNPs“三明治”式复合体。利用去杂交将AuNPs上标记的条形码DNA释放出来,通过DNA探针杂交条形码DNA引起AuNPs颜色变化来确定大肠杆菌O157:H7的存在,这种颜色变化很容易用裸眼观察到并且可以通过紫外-可见吸收光谱定量分析,该方法在纯样品和牛奶中最低检测限为102CFU/mL,检测范围为102～106CFU/mL。应用基于生物条形码探针和AuNPs对大肠杆菌O157:H7检测具有准确、快速、操作简单的优点,为食品安全监测提供了新的方法。     

基于KGdF4:Tb3+纳米材料检测四环素的生物传感新方法

构建了一种荧光共振能量转移生物传感系统检测四环素的方法。以KGd F4:Tb3+纳米粒子为荧光能量供体,氧化石墨烯为荧光能量受体,基于氧化石墨烯对单链DNA的π-π共轭作用,使得适配体功能化的KGd F4:Tb3+纳米粒子与氧化石墨烯足够靠近,从而发生荧光共振能量转移,KGd F4:Tb3+纳米粒子的荧光被淬灭。当体系中存在四环素时,四环素优先与其适配体特异结合形成复合物,与氧化石墨烯结合能力减弱,使得KGd F4:Tb3+纳米粒子的荧光淬灭程度降低,据此可实现对四环素的定量检测。该方法在四环素质量浓度0.5~100 ng/m L范围内与体系荧光强度呈现良好的线性关系(R2=0.993),最低检出限为0.25 ng/m L。该方法特异性好,灵敏度高,已成功应用于实际样品中四环素的测定。     

ε-聚赖氨酸对肠球菌的抑菌作用及机制

天然的ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种安全、健康、营养且抗菌活性强的优良物质。ε-PL对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、霉菌均有一定的抑菌效果。本文研究了ε-PL对肠球菌的最小抑制浓度(MIC),并探讨ε-PL的抑菌机制。结果表明,ε-PL对肠球菌的最小抑菌质量浓度为75μg/m L;ε-PL处理的肠球菌细胞,被检测到细胞膜内外电势改变,ATP大量漏出。通过扫描电镜观察,ε-PL处理的菌体细胞凸起且干瘪;在被处理过的肠球菌上清液中检测到大量的核酸。通过凝胶阻滞实验推测ε-PL与肠球菌DNA结合而达到杀菌作用。由此,ε-PL主要通过改变细胞膜通透性,同时改变细胞膜内外电势,使得细胞内内容物如核酸、ATP等大量渗出并与DNA结合,从而实现对肠球菌的杀菌作用。     

ATP生物发光检测技术的建立及应用可行性分析

建立了测定食品中细菌总数的ATP生物发光检测技术,考察了各种理化因素对生物发光反应的影响。反应体系最优化条件:Ln浓度为70mg/L,FL浓度为50mg/L,Mg2+浓度为0.25mmoL/L,pH为7.2,最适温度为23℃。在10-10～10-15mol/mL范围内,ATP浓度与生物发光强度之间有较好的线性关系,相关系数R2=0.978。方法检出限为10-15mol/mL,批内变异和批间变异分别小于7%和8%。将建立好的ATP生物发光反应体系应用于食品样品中细菌总数的检测,加标回收率范围为82.2%～112.4%,检测结果与平板计数结果相关性良好。因此,建立的ATP生物发光检测技术用于检测食品中细菌总数是可行的。     

霍乱弧菌SDA-琼脂糖凝胶电泳检测技术研究

选取霍乱弧菌ompW基因片段,设计链置换扩增(strand displacement amplification)特异性引物,建立霍乱弧菌SDA快速检测方法,同时对设计的引物的灵敏度、特异性进行研究,结果发现所建立的SDA检测技术对霍乱弧菌的检测灵敏度达到7.0×102cfu/mL,特异性检测发现,SDA技术可以特意性地扩增霍乱弧菌。     

Studies on the ATP3 gene of Saccharomyces cerevisiae: presence of two closely linked copies,ATP3a and ATP3b,on the right arm of chromosome II

In this paper, we present evidence that there are two closely linked copies of the ATP3 gene coding for the gamma subunit of the F(1)F(0)-ATPase complex (EC3.6.1.34) in four laboratory strains of Saccharomyces cerevisiae, even though the yeast genome project has reported that ATP3 is a single-copy gene on chromosome II. We previously reported that the gene dosage (three copies) of ATP1 and ATP2 is coincident with the subunit number of F(1)-alpha and F(1)-beta, but that the gene dosage of ATP3 was not consistent with the subunit stoichiometry of F(1)F(0)-ATPase. By applying long PCR and gene walking analyses, we estimated that the two copies of ATP3 were approximately 20 kb apart, and we designated that which is proximal to the centromere ATP3a, while we named that which is distal ATP3b. The nucleotide sequences of the two copies of ATP3 were identical to the reported sequence in the W303-1A, W303-1B and LL20 strains, while only the DC5 strain had a single base substitution in its ATP3a. With the exception of this substitution, the other nucleotide sequences were identical to the upstream 860 bp and the downstream 150 bp. The differences between ATP3 with the single base substitution (Ser(308) to Phe) and ATP3 without the substitution on the complementation of the ATP3 disruptant and on the maintenance of the mitochondrial DNA were observed, suggesting that Atp3ap and Atp3bp in the DC5 strain might have different functions. However, it should not always be necessary for yeast cells to carry different types of ATP3 because the other three strains carry the same type of ATP3. It was also demonstrated that the disruption of the ATP3 genes basically leads to a loss of wild-type mtDNA, but the stability of the mtDNA is not dependent on the ATP3 alone.     

利用光纤倏逝波生物传感器检测食品中 大肠杆菌O157:H7

目的 建立一种应用光纤倏逝波生物传感器快速检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法。方法 对光纤用大肠杆菌O157:H7抗体包被制备检测探针,用纳米量子点对抗体进行偶联制备检测抗体,并确定其检测的灵敏度和特异性,同时通过对人工污染样品的检测确认该方法检测实际样本的可行性。结果 建立的光纤倏逝波生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度达到50 CFU/mL,并具有较强的特异性。结论 利用光纤倏逝波生物传感器检测食品中污染的大肠杆菌O157:H7方法快速、准确,具有较强应用价值。     

Rapid and sensitive detection of Escherichia coli O157:H7 using coaxial channel-based DNA extraction and microfluidic PCR

In this study, a rapid and sensitive method for detection of Escherichia coli O157:H7 using the coaxial channel-based DNA extraction and the microfluidic PCR was proposed and verified. The magnetic silica beads were first pumped into the coaxial channel, which was captured in the coaxial channel more uniformly by applying the multiring high-gradient magnetic field. After the E. coli O157:H7 cells were lysed with the lysis buffer to release the DNA, the improved coaxial channel was used to efficiently extract the DNA, followed by washing with ethanol to remove the residual proteins and eluting with a small volume of deionized water to obtain the purified and concentrated DNA. Finally, the obtained DNA was amplified and determined using the microfluidic PCR. This proposed bacteria detection method was able to detect E. coli O157:H7 as low as 12 cfu/mL when the large volume (10 mL) of bacterial sample was used, and the recovery of E. coli O157:H7 in the spiked milk samples ranged from 97.4 to 100.6%. This proposed bacteria detection method has shown great potential to detect lower concentration of E. coli O157:H7 from larger volumes of sample.     

恒温隔绝式聚合酶链式反应检测食品中金黄色葡萄球菌

建立一种恒温隔绝式聚合酶链式反应(insulated isothermal polymerase chain reaction,iiPCR)检测食品中金黄色葡萄球菌的方法.根据nuc基因设计特异性引物、探针,并探索针对食品样品快速提取金黄色葡萄球菌模板DNA的方法;通过优化引物、探针及模板的用量,对iiPCR的特异性、...     

快速检测水中的霍乱弧菌

应用化学沉淀剂将霍乱弧菌沉淀聚集于水体下层,加上缓冲溶液,保持其弱碱生长环境,抑制其它细菌的生长,来快速提高霍乱弧菌的检出率.样品离心后,以NaCO3为介质,FeSO4为沉淀剂,在一定的比例下,沉淀水中的霍乱弧菌,弃去上层清液,底液加入碳酸盐缓冲液.用等量双倍浓碱性蛋白胨水增菌、分离、鉴定.此方法无需二次增菌,比常规增菌法缩短近一半的工作周期,且可降低试剂成本,检测灵敏度要高于常规检测法.     

高分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌

为建立一种快速鉴定副溶血性弧茵的HRM（高分辨率熔解曲线）real-timePCR法,以toxR为靶基因,结合特异性引物,通过优化反应体系及条件,进行特异性、敏感性及重复性评价,并初步应用于90份送检的鲜活海产品样本的检测。特异性试睑表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,Tm值为76．64±0．57℃;而与创伤弧菌、霍乱弧茵、金黄色葡萄球菌等多种海产品中常见的食源性病原菌没有交叉反应。灵敏度试验表明,该方法最少可检测toxR重组质粒的浓度为3．50×102copies／mL。重复性试验表明,同一样品于试验内及试验问的平均Tm值分别为76．53±0．35℃和76．74±0．52℃,变异系数分别为0．56±0．42％和1．11±0．73％。对90份鲜活海产品样本的检测证实该法可使阳性检出率从国标法的14．44%高至18．89％。本研究所建立的副溶血性弧菌HRMreal-ILrnePCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能应用于食品样本的检测,具有很好的研究价值和应用前景。     

ATP Screening Method for Presumptive Detection of Microbiologically Contaminated Carbonated Beverages

A rapid adenosine triphosphate (ATP) screening method utilizing a vacuum-filtration procedure was developed for the presumptive detection of yeast and mold contamination in carbonated beverages. First, a baseline of ATP content was established by examining 240 retail cola samples that did not contain detectable microorganisms. Then an additional 182 retail samples were assayed for ATP and Colony Forming Units (CFU). Of these, less than 3% were presumptive-positive by the ATP method. All 182 samples were microbiologically negative for yeast. When 140 cola samples were spiked with various yeast types, more than 89% of samples were correctly identified as presumptive-positive at an arbitrary product specification level of 5 CFU/mL.