产细菌素的饲用乳酸菌的分离与鉴定

禽畜产品中的抗生素残留严重威胁人类的健康,推行无抗养殖的重要途径就是发展发酵饲料。从饲料原料中分离得到能够抑制大肠杆菌生长的乳酸菌,通过排除发酵液中有机酸和H2O2的干扰,初步确定4株具有较强抑菌功能的乳酸菌。分别采用胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶处理发酵上清液后,其抑菌活性减小,初步确定抑菌活性物质为细菌素。进一步通过耐酸、耐胆盐和耐热实验确定1株适合动物肠道定植的乳酸菌R16,生理生化实验和16S rDNA基因序列分析鉴定该菌株为乳酸片球菌R16。筛选获得具有抑菌功能的、适合动物肠道定植和耐饲料加工的饲用乳酸菌对开发无抗发酵饲料具有重要的实用价值。     

一株产广谱细菌素乳酸菌菌株的分离鉴定及其细菌素特性研究

目的:从母乳婴儿粪便筛选获得产广谱细菌素的乳酸菌菌株,并对其所产细菌素的理化及生物学特性进行研究分析,预测其在食品工业中的应用前景。方法:以课题组从母乳婴儿粪便分离得到的23株乳酸菌为试材,采用牛津杯琼脂扩散法,选取单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和大肠杆菌（Escherichia coli）为指示菌筛选产广谱细菌素的优良菌株。通过菌体形态观察、生理生化特征及16S r DNA序列分析对菌株进行分类学鉴定,并从耐酸、耐热、蛋白酶敏感性、抑菌谱等角度分析菌株所产细菌素生物学特性。结果:分离得到1株产广谱细菌素菌株BL-1,发现该菌株所产细菌素具有较好的热稳定性和酸耐受性,在pH为2、121℃条件下细菌素活性仍然保持稳定,酶敏感性强,胃蛋白酶可将其完全分解,使用安全性较高,且抑菌谱较广,对受试的李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aereu）等革兰氏阳性菌和大肠杆菌阴性菌均表现出较强抑菌活性。最后该菌株经分类学鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。结论:从母乳婴儿粪便中分离出一株产广谱细菌素鼠李糖乳杆菌BL-1,该菌所产细菌素具有优良的食品加工特性,有作为天然食品防腐剂的巨大应用前景。      

一株产广谱细菌素乳酸菌菌株的分离鉴定及其细菌素特性研究

目的:从母乳婴儿粪便筛选获得产广谱细菌素的乳酸菌菌株,并对其所产细菌素的理化及生物学特性进行研究分析,预测其在食品工业中的应用前景。方法:以课题组从母乳婴儿粪便分离得到的23株乳酸菌为试材,采用牛津杯琼脂扩散法,选取单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和大肠杆菌(Escherichia coli)为指示菌筛选产广谱细菌素的优良菌株。通过菌体形态观察、生理生化特征及16S r DNA序列分析对菌株进行分类学鉴定,并从耐酸、耐热、蛋白酶敏感性、抑菌谱等角度分析菌株所产细菌素生物学特性。结果:分离得到1株产广谱细菌素菌株BL-1,发现该菌株所产细菌素具有较好的热稳定性和酸耐受性,在pH为2、121℃条件下细菌素活性仍然保持稳定,酶敏感性强,胃蛋白酶可将其完全分解,使用安全性较高,且抑菌谱较广,对受试的李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereu)等革兰氏阳性菌和大肠杆菌阴性菌均表现出较强抑菌活性。最后该菌株经分类学鉴定为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。结论:从母乳婴儿粪便中分离出一株产广谱细菌素鼠李糖乳杆菌BL-1,该菌所产细菌素具有优良的食品加工特性,有作为天然食品防腐剂的巨大应用前景。     

传统干酪中一株产IIa类细菌素乳酸菌的分离与鉴定

从内蒙古传统干酪中分离到一株产抑菌活性物质的乳酸菌M-2，其对单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等食品中常见致病菌和腐败菌都有抑制作用。排除有机酸、H202等的干扰后，仍有抑菌活性：进一步硫酸铵沉淀、透析及浓缩处理后，其抑菌活性显著增强；用蛋白酶K处理后，其抑菌活性消失，因此确定该抑菌活性物质为蛋白类物质，进而确定乳酸菌M-2为细菌素产生菌。通过生理生化实验和16SrRNA基因序列分析对该菌株进行了鉴定。PCR扩增得到1675bp的16SrRNA序列，并将其通过BLAST软件在NCBI网站中进行同源性比，同时，通过Bioedit7．0和Treedrawing软件绘制系统发育树。结果显示，M-2的16SrRNA序列和数据库中的屎肠球菌SF菌株的序列的同源性为99．87％。在细菌系统发育分类学上，M-2菌株归属屎肠球菌（Enterococcus faecium）。这与生理生化实验初步鉴定结果一致。根据细菌素的分类原则，将该细菌素归类为IIa类细菌素。     

一株乳酸乳球菌所产细菌素的生物学特性

对乳酸乳球菌KLDS4.0326所产类细菌素进行分离纯化,并对细菌素的部分生物学特性进行研究。在排除酸性产物和过氧化氢的干扰后,菌株的无细胞发酵上清液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌以及大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性细菌具有显著的抑制作用;经胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后,抑菌活性降低,表明抑菌成分为蛋白类物质;该细菌素具有良好的热稳定性,在酸性条件下抑菌活性稳定,并且具有较广的抑菌谱,能够抑制多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。     

传统干酪中一株产Ⅱa类细菌素乳酸菌的分离与鉴定

从内蒙古传统干酪中分离到一株产抑菌活性物质的乳酸菌M-2,其对单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等食品中常见致病菌和腐败菌都有抑制作用.排除有机酸、H2O2等的干扰后,仍有抑菌活性;进一步硫酸铵沉淀、透析及浓缩处理后,其抑菌活性显著增强;用蛋白酶K处理后,其抑菌活性消失,因此确定该抑菌活性物质为蛋白类物质,进而确定乳酸菌M-2为细菌素产生菌.通过生理生化实验和16SrRNA基因序列分析对该菌株进行了鉴定.PCR扩增得到1675bp的16SrRNA序列,并将其通过BLAST软件在NCBI网站中进行同源性比,同时,通过Bioedit 7.0和Treedrawing软件绘制系统发育树.结果显示,M-2的16S rRNA序列和数据库中的屎肠球菌SF菌株的序列的同源性为99.87%.在细菌系统发育分类学上,M-2菌株归属屎肠球菌(Enterococcus faecium).这与生理生化实验初步鉴定结果一致.根据细菌素的分类原则,将该细菌素归类为IIa类细菌素.     

产抗李斯特菌细菌素乳酸菌的筛选与鉴定

从51株肠球菌中筛选出2株具有抑制李斯特菌活性的肠球菌菌株:肠球菌KLDS6.0610和肠球菌KLDS6.0611。在排除有机酸和过氧化氢的干扰后,2株菌的无细胞发酵上清液对指示菌还有强烈的抑制作用。经蛋白酶K处理后,抑菌活性丧失,证明无细胞发酵上清液中含有蛋白性质的抑菌物质,即细菌素。经菌体形态和16SrDNA序列同源性分析鉴定2株肠球菌均为粪肠球菌。     

一株产细菌素乳酸菌的分离、鉴定及生物学特性研究

从豆制品工厂自然发酵的豆清蛋白发酵液中分离得到一株产细菌素的乳酸菌,编号为NLB-3。通过排除发酵液中有机酸、过氧化氢对指示菌的抑菌作用,及抑菌物质的蛋白酶稳定性试验,初步确定菌株NLB-3的抑菌物质为细菌素。结合菌株NLB-3的菌落及菌体形态、生理生化特征及16SrDAN测序结果,初步将其鉴定为乳杆菌属NLB-3(Lactobacillus sp.NLB-3)。菌株NLB-3的生物学特性表明,该菌株最适生长温度为35℃,菌株在该温度下发酵16h后菌液pH低至3.45,菌株NLB-3有较广的盐耐受范围,当NaCl浓度大于10%时,菌株的生长受到明显抑制。     

一株产细菌素乳杆菌的鉴定及其细菌素编码基因的获得

应用双层平板打孔法,从自制樱桃酒里分离的乳杆菌中筛选到一株对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有明显抑制作用的菌株,命名为LD 1.0008。通过API 50 CHL糖发酵产酸实验、16S rDNA基因序列分析及其特异性recA基因多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,鉴定LD 1.0008为植物乳杆菌。排除有机酸的干扰,用多种蛋白酶处理后,其抑菌活性均有明显降低,而用过氧化氢酶处理后其抑菌活性基本不变,从而确定LD 1.0008所产生的抑菌物质为细菌素。使用已报道的10 对植物乳杆菌细菌素基因片段设计的引物对菌株LD 1.0008进行PCR扩增,发现其至少含有4 个植物乳杆菌素相关编码基因,即plnD、plnO、plnV和plnW。     

产细菌素乳酸菌的筛选及鉴定

采用琼脂平板扩散实验,从湖南传统发酵腊肉和香肠中筛选出3株对单核增生李斯特菌(Listeria monocytogene54002)具有明显抑制作用的乳酸菌,排除酸和过氧化氢的干扰后,仍具有抑菌活性,而用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理以后,其抑菌活性消失,因此确定该抑菌物质为蛋白质类物质,即细菌素。三株菌所产细菌素具有一定热稳定性,在pH5~10之间仍具有一定的抑菌活性。通过生理生化实验和16S rRNA基因序列分析对3株菌进行了鉴定。PCR扩增得到1600bp左右的16S rRNA基因序列,将序列通过BLAST软件在NCBI网站上进行同源性对比,并通过MEGA5.0软件绘制系统发育树。结果显示3株菌的16S rRNA序列和数据库中的屎肠球菌的序列同源性均在99%以上,这与生理生化实验初步鉴定结果一致。      

从酸白菜中分离出一株产细菌素的乳酸片球菌

本试验从酸白菜中分离出一株有抑制单核细胞增多症李氏杆菌作用的菌株,经鉴定为乳酸片球菌,还对植物乳杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等革兰氏阳性细菌有抗菌作用。该抗菌物质对蛋白水解酶敏感、对过氧化氢酶不敏感、耐热、在较宽的pH范围内保持活性。在排除是有机酸和过氧化氢后,初步认为该菌产生的抗菌物质为抗菌肽,即细菌素。     

L.LactisKLDS4.0325细菌素理化性质的研究

该研究以分离自新疆牧民家庭自制酸马奶中的乳酸乳球菌KLDS4.0325为研究对象,以双层平板法为检测方法,以抑菌圈直径为检测指标,以大肠杆菌为指示菌,对该菌株所产细菌素进行提取、纯化及理化特性分析,首先无细胞发酵上清液通过60%饱和度硫酸铵溶液盐析得到细菌素粗提液,然后细菌素粗提液通过SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析法得到纯化的细菌素样品,其比活力可达51.02 IU/mg,较优化前提高了约18倍,并通过tricine-SDS-PAGE蛋白电泳测定分子量约为3.4 ku;最后,对细菌素样品的生物学特性进行研究,通过温度、pH和各种酶的敏感性试验得出,细菌素样品热稳定性强,在pH 2~10的范围抑菌圈直径变化不大,有较高的稳定性,经蛋白酶处理后,抑菌活性消失,但经淀粉酶处理后仍能保持较高的稳定性,这也说明该细菌素是蛋白类物质。     

产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定

从蒙古国风干牛肉中分离出28株乳酸菌,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌为指示菌检测28株乳酸菌的抑菌活性,其中菌株37X-3和菌株37X-13对3种指示菌的抑菌能力较强,且经胃蛋白酶和蛋白酶K处理后抑菌活性全部丧失,表明2株乳酸菌通过产细菌素的方式发挥抑菌作用。再经表型、生理生化和基因型鉴定,确定菌株37X-3为戊糖片球菌,菌株37X-13为乳酸片球菌。2种片球菌素在121 ℃,15 min,pH 2～6范围均能抑制3种指示菌的生长,且对单核增生李斯特菌抑菌作用最强。2种片球菌素抑菌谱广,不仅能抑制枯草芽孢杆菌、屎肠球菌等革兰氏阳性菌,还能抑制沙门氏菌、志贺氏菌等革兰氏阴性菌。     

产细菌素乳酸菌的筛选及鉴定

从传统发酵制品中分离筛选到50株乳酸菌,通过琼脂扩散法从中筛选出5株对指示菌具有明显抑菌作用的菌株,通过排除酸和过氧化氢的作用后,其中一株菌仍具有一定的抑菌活性。用胰蛋白酶对其发酵液进行处理后,活性下降很大,说明代谢产物中含有蛋白性质的抑菌物质,可能是细菌素。对此菌株进行鉴定,初步认为是戊糖乳杆菌,并对其生长能力和产酸能力进行了测定。      

产细菌素弯曲乳杆菌的分离鉴定及细菌素特性初步研究

从西班牙传统色拉米香肠中分离到一株产细菌素菌株RX-6,其发酵液在排除有机酸、过氧化氢及菌体细胞干扰后,抑菌活性基本无变化;经硫酸铵盐析及透析处理后,抑菌活性明显增强;蛋白酶K处理后,抑菌活性消失,表明起抑菌作用的是蛋白类物质.通过菌体形态观察、生理生化特征实验、16S rRNA序列比对及系统发育分析,鉴定菌株RX-6为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus).抑菌特性研究结果显示该菌株所产细菌素具有很好的热稳定性和酸碱耐受性,在121℃20min的高温处理后仍能保持一定活性,活性pH范围为3～10;使用安全性高,胃蛋白酶和胰蛋白酶可将其完全分解,而酸性蛋白酶可将其部分分解;抑菌谱较广,对受试的7株李斯特菌(Listeria spp.)、3株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereu)、1株大肠杆菌(Escherichia coli及1株假单胞菌(Pseudomonas spp.)等都有明显抑制作用,显示出作为天然食品生物防腐剂的巨大应用潜力.     

不同来源产细菌素乳酸菌的分离筛选及鉴定研究

从自制的发酵胡萝卜汁、泡菜汁、黄瓜汁、黄豆汁、绿豆汁,以及市售的蜂蜜、鲜奶、干酪中,通过琼脂扩散法最终筛选出有1株乳酸菌具有良好的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌以及沙门氏菌的作用.以单核细胞增生李斯特菌为指示菌,通过排出有机酸、过氧化氢的干扰因素后,发酵离心液用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后,发酵液的抑菌活性急剧下降,从而确定产生的抑菌物质具有蛋白质性质,是一种细菌素.经过形态学测试及生理生化反应试验,最后确定这株菌为鼠李糖乳杆菌.     

一株从泡菜中分离的产细菌素乳杆菌的鉴定及细菌素特性研究

从泡菜中分离的329 株乳酸菌中,筛选出一株产细菌素的乳酸菌,编号为SD-22。经生理生化实验鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。在排除过氧化氢干扰和有机酸抑菌作用后,brevicin SD-22 对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有较好的抑制作用,对部分真菌也有抑制作用,但对酵母菌和青霉无抑制作用,具有良好的热稳定性和pH 值稳定性,经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 处理后抑菌活性完全消失,对α- 淀粉酶不敏感。因此初步认为该菌株是一株产广谱细菌素的乳酸菌。     

一株产细菌素细菌CGMCC 6624分离鉴定及其生物学特性

采用牛津杯法,从山西陈醋新鲜醋醅中分离筛选得到1株产广谱、高效抑菌活性物质的细菌CGMCC 6624。采用酸抑菌排除试验、过氧化氢抑菌排除试验、蛋白酶消化试验、研究菌株生长与抑菌物质代谢特性的关系和菌株CGMCC 6624对自产抑菌物质的免疫性,结果表明细菌CGMCC 6624发酵产生的抑菌物质为H2O2和细菌素。基于形态学观察、生理生化特征分析及16S rDNA基因序列系统发育分析的微生物分类鉴定技术,菌株CGMCC 6624 被鉴定为枯草芽孢杆菌。通过对酸碱、温度、乙醇度的耐受性的研究发现,该菌株可在pH 2～11、乙醇体积分数0%～8%、温度25～50 ℃条件下生长,最优培养温度 30 ℃,pH 5.0。本研究结果为该菌株在微生态制剂和细菌素的开发利用及在山西传统酿造食品中的应用奠定基础。     

产细菌素弯曲乳杆菌的分离鉴定及细菌素特性初步研究

从西班牙传统色拉米香肠中分离到一株产细菌素菌株RX-6,其发酵液在排除有机酸、过氧化氢及菌体细胞干扰后,抑菌活性基本无变化;经硫酸铵盐析及透析处理后,抑菌活性明显增强;蛋白酶K处理后,抑菌活性消失,表明起抑菌作用的是蛋白类物质。通过菌体形态观察、生理生化特征实验、16SrRNA序列比对及系统发育分析,鉴定菌株RX-6为弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）。抑菌特性研究结果显示该菌株所产细菌素具有很好的热稳定性和酸碱耐受性,在121℃20min的高温处理后仍能保持一定活性,活性pH范围为3¹0;使用安全性高,胃蛋白酶和胰蛋白酶可将其完全分解,而酸性蛋白酶可将其部分分解;抑菌谱较广,对受试的7株李斯特菌（Listeria spp.）、3株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aereu）、1株大肠杆菌（Escherichia coli）及1株假单胞菌（Pseudomonas spp.）等都有明显抑制作用,显示出作为天然食品生物防腐剂的巨大应用潜力。      

乳酸乳球菌KLDS4.0325产细菌素最佳培养条件的研究

以分离自新疆牧民家庭自制酸马奶中的乳酸乳球菌KLDS4.0325为研究对象,以大肠杆菌为指示菌,以抑菌圈直径为考察指标,考察了不同温度、p H、转速及培养时间等培养条件对该菌株细菌素产量的影响,经单因素实验优化得出乳酸乳球菌KLDS4.0325在培养温度33℃,培养基初始p H7.0,120 r/min摇床培养20 h的条件下,无细胞发酵上清液对大肠杆菌的抑菌圈直径最大,抑菌活性最强,细菌素产量最高。在此条件下,抑菌圈直径为25.26 mm,细菌素效价可达5383.07 IU/m L。