栉孔扇贝血细胞的吞噬作用及其扫描电镜研究

用透射电镜和扫描电镜技术对栉孔扇贝血细胞的吞噬作用和表面结构进行了研究,结果表明,栉孔扇贝血细胞对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有很强的吞噬能力,注射细菌15h后,吞噬率分别达25％和27％,小颗粒（嗜中性颗粒）细胞吞噬能力最强,中颗粒（嗜碱性颗粒）细胞吞噬能力较弱,大颗粒（嗜酸性颗粒）细胞无吞噬能力,无颗粒细胞中只有少量较大的细胞具有吞噬能力。吞噬体不断与小空泡（初级溶酶体）融和形成大的吞噬体,并在其内将细菌逐步消化降解,吞噬体中的细菌也可被分散包围成多个小吞噬体后分别被降解。扫描电镜观察栉孔扇贝血细胞的圆形、椭圆形和梭形三种形状,多数血细胞容量变形形成伪足,可形成大量长的纤维状伪足的血细胞具有凝血的功能。     

栉孔扇贝种群的遗传变异分析

采用不连续聚烯酰胺凝胶电泳技术研究了中国栉孔扇贝和日本栉孔扇贝两个天然种群的六种同工酶。结果表明,两个种群具有基本相同的基因位点控制同工酶的表达,二者都具有居群内的个体差异,中国和日本的两个种群的多态位点比例（P．99）分别为41．18％和45．45％,平均杂合度观测值（Ho)分别为0．1295和0．1531,平均杂合度预期值（He)分别为0．1695和0．2331,各位点平均等位基因数（Ne)分别为1．5294和1．6363。日本栉孔扇贝自然种群的遗传变异明显高于中国栉孔扇贝自然种群。同时各群体中普遍存在杂合子缺失现象。     

栉孔扇贝×虾夷扇贝子一代杂种优势的RAPD分析

应用RAPD技术对栉孔扇贝×虾夷扇贝子一代的杂种优势进行了研究,对栉孔扇贝(C)、虾夷扇贝(P)及其正交F1(C♀×P♂)、反交F1(P♀×C♂)共4个群体的RAPD扩增带谱进行了分析。从40个随机引物中筛选出16个扩增带丰富的引物进行扩增,共得到l15条清晰稳定的扩增带,扩增片段大小在200～2000bp之间,其中有82个扩增位点具有多态性,多态性位点比率为71.3%。栉孔扇贝与正反交子代的相对遗传距离分别为0.0852和0.2886;虾夷扇贝与正反交子代的相对遗传距离分别为0.2327和0.0559,杂种子代与两亲本的遗传差异不是对等的,而是偏向各自的母本,系统树、Shannon多样性指数同样证明了这一点。两亲本群体内相似性指数分别为0.8392和0.8451,均大于正交子代的群体内相似性指数,而小于反交子代的群体内相似性指数,表明正交子代群体的遗传多样性水平升高,产生杂种优势;反交降低,未产生明显的杂种优势,与4个群体Shannon遗传多样性指数计算分析结果一致。     

栉孔扇贝EST中微卫星标记的筛选

使用RepeatMasker软件在栉孔扇贝的6935条ESTs中发现了42条微卫星序列。选取其中的7个序列，根据微卫星位点的旁侧序列设计引物，并对设计出的引物在中国、日本、韩国野生群体中进行多态性检测，发现有6对引物能产生扩增产物，其中有3对引物可望在以后的群体分析及连锁图谱的构建中加以应用。该结果初步证实了在栉孔扇贝的ESTs序列中存在微卫星位点，从而为扇贝生物中微卫星标记的筛选开辟了新的途径。     

栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染与疾病发生关系探讨

超薄切片和负染色技术检测栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染状况，结果表明：在栉孔扇贝大规模死亡的7、8月份，病毒检出率分别为80％、100％，此时，病毒感染强度也达到最高；而海湾扇贝整个养殖期间病毒感染率和感染强度均维持在较低的水平，未出现明显的涨落。二种扇贝均检测到类立克次氏体（RLO），但类立克次氏体的感染率和感染强度均未出现明显的涨落，似与扇贝死亡的关系不大。综合分析认为，病毒极可能是导致栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。     

盐度突降对栉孔扇贝(Chlamys farreri)抗病力指标的影响

通过室内模拟实验研究了海水盐度突降对栉孔扇贝抗病力的影响.设盐度20、25两个处理,以盐度31为对照.将扇贝从盐度31的暂养海水直接转到设计盐度,分别于0h、1h、4h、12h、24h、48h、72h采血分析血细胞数目、血浆蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性.72h注射细菌攻毒,记录存活率.结果表明,盐度突降使血细胞数和SOD活性总体下降,而血浆蛋白含量和ACP活性总体升高.攻毒引起的上述抗病力指标的变化趋势与盐度突降相同,但处理组的响应幅度均低于对照,存活率显著降低.上述结果说明盐度突降损害了栉孔扇贝抵抗感染的能力.     

栉孔扇贝不同地理群体的遗传多样性分析

应用AFLP技术对栉孔扇贝的中国长岛群体和韩国东部、西部群体进行了遗传多样性分析。实验表明，中国长岛群体的群体内遗传相似度最高，为0．6754，韩国东部群体次之，为0．6714，韩国西部群体最低，为0．6309；中国长岛群体与韩国东部、西部群体间的遗传距离分别为0．1703和0．1786，韩国两群体间的遗传距离只有0．057。这一结果说明，长岛群体与韩国群体遗传差异较大，韩国两个群体遗传相似度较高，应视为同一个群体。本研究共获得6个韩国两群体的共享特征标记，4个长岛群体的特异性标记，1个韩国西部群体所特有的标记，这些标记可以用于鉴定和区分这三个群体。为提高我国栉孔扇贝群体遗传多样性，以引进韩国西部群体为好。     

中日栉孔扇贝杂交子一代群体的遗传变异

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，研究了中国栉孔扇贝和日本栉孔扇贝的两组杂交子代群体的14个位点24个等位基因。将它们各自的自交子一代作为亲本的参照组，对这四组子代群体进行了遗传变异分析，结果表明：四组群体具有相同的基因位点控制同工酶的表达，但各位点等位基因的频率有所不同。统计结果表明：杂交群体的遗传变异明显高于自交群体的遗传变异，四组群体的多态位点比例（P.99）分别为36.36%（CP中自交组）、30.77%（JP日自交组）、30.77%（JFCM日雌中雄杂交组）、30.77%（JM-CF日雄中雌杂交组），平均杂合度观测值（Ho）分别为0.1273（CP）、0.1055（JP)、0.1536（JFCM）、0.1727（JMCF)，各位点平均有效等位基因数（Ae）分别为0.7318（CP）、1.6718（JP）、1.6955(JFCM)、1.6927（JMCF）。杂交优势已初步显示出来。     

栉孔扇贝酸性α-醋酸萘酯酶的组织化学研究

采用酶组织化学方法对栉孔扇贝(Chlamys farreri)各主要器官组织中的酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)进行了定性定位研究。结果表明，栉孔扇贝的大部分器官，包括：外套膜、鳃、唇瓣、口唇、胃、肠、直肠、肝脏、肾脏、生殖腺、心脏和闭壳肌，其上皮组织和大血窦多呈很强的ANAE阳性( )；血细胞呈ANAE强阳性( )；结缔组织和肌纤维呈ANAE较强阳性( )或弱阳性( )；肝脏肝小叶呈较强的ANAE阳性；肾脏肾小管呈ANAE强阳性。生殖腺滤泡呈很强的ANAE阳性。     

栉孔扇贝外套膜酸性和碱性磷酸酶电镜细胞化学研究

采用电镜细胞化学技术对栉孔贝（Chlamys farreri）外套膜中的酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）进行了定性定位研究。结果表明，外套膜的所有上皮细胞和结缔组织中部分务细胞呈ACP强阳性。上皮细胞中高电子密度阳性颗粒多为圆形，直径300－450mm；内多也呈ACP强阳性；微绒毛等呈弱阳性。血细胞中次级溶酶体内有数目和大小不同的ACP强阳性颗粒；内质网等内膜系统呈ACP弱阳性。外套膜的所有上皮细胞和血细胞均呈AKP强阳性。AKP阳性颗粒常沿着细胞膜分布；内质网等内膜系统呈AKP强阳性；上皮细胞中一种近圆形直径约250－420nm的颗粒也呈AKP强阳性。     

栉孔扇贝血淋巴细胞HSP70表达变化的FCM法检测

建立了热激、冷激、细菌感染和水质恶化等逆境中栉孔扇贝血淋巴细胞HSP70表达变化的流式细胞术检测法。结果发现,该方法可灵敏检出上述条件下,血淋巴细胞中HSP70表达的增加。Duncan检验显示,热激条件下HSP70表达增加最为显著。     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

急性病毒性坏死症病毒在栉孔扇贝不同器官的感染状况

应用超薄切片、负染电镜技术以及ELISA对自然发病和人工感染发病的栉孔扇贝之外套膜、鳃、肝胰腺、肾、肠、及闭壳肌等主要器官急性病毒性坏死症(Acute Virus Necrobiotic Disease，AVND)病毒的感染状况进行了研究。三种检测方法均表明，病贝的外套膜及肝胰腺为AVND病毒感染最严重的器官，肾以及肠组织次之，鳃及闭壳肌病毒感染程度最轻。本结果同时表明，AVND病毒在病贝体内广泛分布，侵染的细胞主要为上述器官皮下肌细胞的细胞质内，侵染细胞超微结构表现为生物膜肿胀，并出现“髓袢样”结构等病理变化。     

温度刺激下栉孔扇贝不同组织热休克蛋白HSP70的表达研究

采用免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)方法,研究了热激栉孔扇贝不同组织内热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表达变化。免疫印迹结果显示,HSP70的诱导表达有组织特异性,即热休克可以使扇贝鳃组织中HSP70的表达明显升高,但在肌柱、外套膜和性腺组织中,未检测到HSP70的表达。流式细胞术结果表明：在不同的季节,相同的热刺激对扇贝血淋巴中HSP70的诱导表达存在差异。高温刺激后,栉孔扇贝血淋巴细胞中HSP70的表达量逐渐升高,在诱导7h时达到最高。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒感染的ELISA检测

应用纯化病毒免疫新西兰兔制备的抗血清，进行ELISA分析，检测栉孔扇贝体内急性病毒性坏死症病毒的感染情况。结果表明：一龄贝在整个养殖期间感染该病毒呈现低一高一低的涨落过程，其中7月下旬到8月中旬检出阳性率为75％～95％，为当年感染的高峰时期。对二龄贝感染该病毒的分析结果显示，二龄贝对病毒的感染可能具有一定的抗性。