代谢工程改造大肠杆菌发酵生产β-烟酰胺单核苷酸

为实现大肠杆菌高效生产β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN）,设计模块化代谢改造策略。首先,对烟酰胺（nicotinamide,NAM）和β-NMN支路代谢涉及的8个酶进行失活,减少底盘细胞对前体和产物的额外消耗。其次,通过引入NAM输入蛋白（Bc NiaP）、β-NMN输出蛋白（Bm PnuC）、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶（5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate?synthetase,Prs）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide?phosphoribosyl?transferase,Nampt）,敲除调节蛋白PurR,工程菌N12’摇瓶发酵可积累0.34 g/L的β-NMN;此后,比对筛选发现Comamonadaceae?bacterium来源的Nampt活性较高且对底盘细胞负担较小;通过进一步强化Bm PnuC和Prs的表达水平,工程菌N18摇瓶发酵β-NMN产量提高至1.36 g/L。最后,利用发酵罐分批补料发酵38 h,β-NMN产量达到10.2 g/L,NAM到β-NMN的摩尔转化...     

高效液相色谱法同时测定烟酰胺单核苷酸中5种有关物质

目的 构建同时检测烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)中5种有关物质[烟酰胺氧化物、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)及烟酰胺]含量的高效液相色谱法。方法 采用C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液(用磷酸调节pH为4.5)-甲醇为流动相进行梯度洗脱,流速为1 mL/min,进样量为20μL,检测波长210 nm,柱温20℃,试样盘控温:5℃,并对方法的专属性、灵敏性、准确性、重复性、耐用性及适用性进行验证。结果 烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP及烟酰胺分别在质量浓度0.4060～16.2402、0.4110～16.4403、0.4150～16.6010、0.4163～16.6507、0.4028～16.1206μg/mL范围内,质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系,线性系数r²     

烟酰胺单核苷酸功能研究进展

近年来，烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,NMN)已经成为热门的保健品原材料，其延缓衰老、治疗糖尿病、治疗神经性疾病等有益生理功能引起了人们的广泛关注。NMN在人体内通过合成辅酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD⁺)来发挥相应的生理功能。NMN可以有效提高人体内NAD+的含量，目前的研究尚未发现NMN有较强的毒理性质。文章较为系统地总结了NMN的作用机制、功能研究进展、食用安全性和生物利用度，旨在为进一步研究NMN的生理功能提供参考。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂王幼虫中烟酰胺单核苷酸的含量

建立了超高效液相色谱-串联质谱快速测定蜂王幼虫中烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)的方法.样品经乙醇和水提取后,采用Waters X Select HSS T3(2.1 mm×100 mm,2.5μm)色谱柱进行分离,串联质谱多反应监测模式定量分析.该方法中NMN在50～1...     

β-烟酰胺单核苷酸跨境产品中NMN含量的测定

本文基于高效液相色谱法,通过优化色谱条件和样品前处理条件,建立了一种测定β-烟酰胺单核苷酸(NMN)胶囊和NMN片剂基质中NMN含量的检测方法,并进行方法学验证.结果表明,本方法在5～500μg/mL范围内有较好的线性关系,方法检出限(LOD,S/N=3)为1.0 mg/kg,定量限(LOQ,S/N=10)为3.0 m...     

烟酰胺单核苷酸的生理功能及其在药品和食品中的应用

烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）是辅酶I-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）合成的关键中间体,有α和β两种异构体存在形式,其中β异构体是NMN的活性形式,存在于多种生物内。研究发现,NMN对肠道健康、心脑血管疾病、神经退行性疾病、延缓衰老等有较好的作用,此外,NMN还可以通过参与调节机体的内分泌,增加胰岛素的分泌,进而防治肥胖和糖尿病的发生。目前,在美国和日本均已允许NMN作为食品原料进行食品生产。人们对含有NMN成分的保健产品需求也日益增加,因此,NMN已经成为保健品、食品原料等领域研究的热点,其市场份额也在迅速增加。文章系统地综述了NMN的基本性质、生理作用、保健功能及其在药品、食品上的应用,旨在为NMN的开发和应用研究提供理论参考。     

β-烟酰胺单核苷酸对生理机能影响的研究进展

我国处于亚健康状态的超重或肥胖人群与老龄化人口数量都在逐年上升。在衰老和肥胖过程中,细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD＋）水平会发生系统性下降。NAD＋是细胞能量代谢、调节细胞机能、影响衰老的关键靶点,因此,通过补充NAD＋前体以改善生理机能、延缓衰老已经成为目前研究热点。β-烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）是动物体内NAD＋代谢的中间产物,也是目前最直接高效的NAD＋补充前体。但是NMN对生理机能存在多方面多器官的复杂影响,而且人体临床试验与动物实验结果并不一致,服用量也尚未确定。本文综述到目前为止NMN的动物实验和人体临床试验结果,旨在探究补充NMN对动物、人体生理机能的影响、机制及其适宜剂量和不良反应,以期为未来NMN研究与应用提供思路。     

基于双菌耦合发酵策略的烟酰胺单核苷酸合成

本研究构建了分别含有烟酰胺核苷激酶（nicotinamideribosidekinase,NRK）和多聚磷酸酶（polyphosphatekinase,PPK）的双菌耦合发酵体系，实现了基于PPK的ATP再生系统在烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）生产中的应用。首先分别构建表达NRK1和NRK2的工程菌株，筛选得到高活性的大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)-pET28a-NRK1,NMN产量5.17 g/L，产率77.4%；然后对NRK1的诱导表达条件进行优化，发现低温16℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷0.7 mmol/L、接种量3%、诱导时长22 h更利于蛋白的可溶性表达；进一步对E. coli BL21(DE3)-pET28a-NRK1合成NMN的最优体系进行探索，发现在菌体质量浓度100 g/L、温度18℃、时间12 h、ATP与烟酰胺核糖（nicotinamide riboside,NR）浓度比1∶1.5时，NMN产量最高为5.73 g/L，产率85.78%；最后，通过对E. coli BL21(...     

液相色谱-质谱联用法测定营养强化粉中烟酰胺的含量

目的在国标GB/T 5009.197-2003基础上,建立一种液相色谱-质谱联用法(liquid chromatographymass spectrometry,LC-MS)测定营养强化粉中烟酰胺含量的方法。方法样品经过0.1%甲酸水(含20%甲醇)提取,超声、定容后离心等处理后过滤上机待测。仪器条件为:色谱柱C18(10 cm×4.6 mm,3μm);流速:0.4 m L/min;流动相:水相:乙腈=50:50(V:V);离子峰为(m/z 121.1);选择子离子m/z 80.1和m/z 71.9分别作为定量离子和定性离子。结果该方法中烟酰胺的检出限为1.5μg/g,线性范围为0.0625~0.308μg/m L(r~2=0.9993)。加标平均回收率为96.05%~101.47%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.4%~1.7%(n=3)。结论本研究建立的方法准确性高,不受样品中杂质峰的影响,同时操作简单、快速,适用于营养强化粉中烟酰胺的测定。     

在线固相萃取-二维液相色谱法同时测定儿童配方奶粉中维生素A、D、E

建立在线固相萃取(SPE)-二维液相色谱法同时测定儿童配方奶粉中脂溶性维生素A、D₂、D₃和α-、β-、γ-、δ-维生素E含量的方法。样品经皂化后直接进样,以聚合物为填料的PLRP-S色谱柱为在线固相萃取柱净化皂化液,采用SPE泵反向洗脱目标组分,并通过引入在线稀释将目标组分聚焦在第一维色谱柱柱头。以NuovaSil^TM PFP(4.6 mm×150 mm,3μm)为第一维色谱柱,甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,分离维生素A和E的4种异构体。以ChromCore PAH(4.6 mm×150 mm,3μm)为第二维色谱柱,甲醇-乙腈(90:10,v/v)为流动相,分离维生素D₂和D₃。结果表明,维生素A在5.0～500.0 ng/mL、维生素D在1.0～100.0 ng/mL、维生素E在50.0～5000.0 ng/mL线性范围内线性良好,相关系数均大于0.9999。维生素A、D₂、D₃和α-、β-、γ-、δ-维生素E的...     

功能性面料中烟酰胺含量的测定

为确定功能性面料中烟酰胺含量的测定方法,在弱酸环境下超声萃取,后经液相色谱碳18柱分离,在液相色谱-质谱联用仪(LC/MS)器中用外标法检测定量。结果表明,烟酰胺在1.000～20.000 mg/L与积分面积呈现良好的线性关系,回归方程为y=269 916x+143 786,曲线的相关系数R²=0.998 1,所选某品牌的功能性面料中烟酰胺质量分数达892.6 mg/kg。该方法操作简单、快速准确、干扰少,可用于功能面料中烟酰胺含量的测定。     

烟酰胺单核苷酸分子印迹微球的制备及其吸附性能研究

以烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)为模板分子,α-甲基丙烯酸为功能单体,N,N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,采用沉淀聚合法制备NMN分子印迹微球。对分子印迹微球制备工艺进行优化,当模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶2∶10、乙腈-水(体积比3∶1)用量12 mL、聚合温度60℃时,制备的分子印迹微球吸附效果最好。静态吸附结果表明,所制得的分子印迹微球对NMN有较强的吸附能力;动态吸附结果表明,该分子印迹微球在60 min左右达到吸附平衡、对NMN的吸附过程更符合准二级动力学方程。该分子印迹微球用于固相萃取西兰花提取液中的NMN时,展现了较高的应用性能,对NMN分子印迹微球的制备优化和应用具有参考和指导意义。     

重组大肠杆菌全细胞催化合成NMN

基于前期研究构建的一株能以烟酰胺(nicotinamide,NAM)和葡萄糖为底物高产β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)-NF017,采用全细胞催化方式进行NMN合成。首先,在摇瓶水平上对菌株培养过程的发酵培养基类型、诱导温度和诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,以及全细胞催化过程的反应体系初始pH、反应温度和底物NAM与葡萄糖的添加比例（质量浓度比）进行了优化,在最优条件下,NMN的生成量（质量浓度）达1.84 g/L。为了进一步提高NMN的生成量,在5 L发酵罐上对全细胞催化过程中溶氧水平和底物NAM的流加方式进行控制和优化。最终,应用恒定速度流加NAM的补料模式,NMN的生成量提高至12.24 g/L,底物NAM的摩尔转化率达85.65%。该研究结果为应用全细胞催化法生产NMN提供了一定参考。     

核磁共振波谱法同时定量测定保健品中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其前体化合物

目的 建立可同时测定保健品中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)及其前体化合物含量的核磁共振波谱法。方法 采用核磁共振波谱技术，优化检测条件后，开发了标准曲线法和定量核磁共振(quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)法两种定量检测方法，用于测定保健品中2种形式的NAD及其4种前体化合物。结果 确定了各目标化合物的特征峰。对于标准曲线法，6种目标化合物的线性关系良好(≥0.9999)，除烟酰胺(nicotinamide，NAM)的定量限为0.5 mmol/L外，其他5种目标化合物的定量限均为0.2 mmol/L。考察了两种具有代表性的NAD+前体化合物的日间和日内重现性，烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)和NAM的日间重现性分别为0.21%和0.37%，日内重现性分别为1.03%和1.44%。用标准曲线法和qNMR两种方法分别对收集的10个NAD+补充剂保健品进行检测，误差合理(<5%)。结论 建立的核磁共振方法具有良好的可靠性和灵敏度，可用于保健品中NAD+及其前体化合物的生产控制和市场监管。     

烟酰胺磷酸核糖转移酶在大肠杆菌中的表达及催化合成烟酰胺单核苷酸

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase,Nampt)是生物酶法合成烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide ribotide,NMN)中重要的酶,催化烟酰胺(Nicotinamide,NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)合成NMN。本研究将来源Meiothermus ruber的Nampt在大肠杆菌系统进行胞内表达,表达产物经纯化后进行酶学性质分析,并进一步将其用于催化合成NMN。将重组菌株在16℃低温下进行摇瓶水平诱导21 h,收集发酵菌体并进行超声破碎,破碎后上清利用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,SDS-PAGE结果显示表达与纯化后的产物大小约55 ku,与预期的蛋白分子量相符。重组Nampt的最适反应温度为45℃,最适p H为6。酶动力学分析显示,该酶对底物NAM催化的Km、Vmax、kcat分别是0.39μmol/L、3.20μmol/(mg·min)、1.391/s。使用该酶催化生产NMN,通过反应中补加一次底物PRPP,反应10min产物NMN产量可达30 mg/L。本研究成功表达一个酶学性质和热稳定性优良的Nampt,并将其应用在单酶催化生产NMN时有较高的产量和生产效率,为生物酶法合成NMN的应用研究奠定了基础。     

SPE净化-UPLC-MS/MS法测定食品中二氢槲皮素

试验旨在建立食品中二氢槲皮素的超高效液相色谱-串联质谱定性定量检测方法.试样经甲醇-2％乙酸(1∶1,V/V)超声提取后,采用亲水-疏水平衡固相萃取柱(hydrophile-lipophile balance,HLB)固相萃取(solid phase extraction,SPE)净化,HSS T3色谱柱分离,以乙腈-...     

超临界CO_2流体色谱分离α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮

采用超临界CO2流体色谱分离α-紫罗兰酮与β-紫罗兰酮2个异构体,考察了改性剂浓度、柱温、柱压对容量因子和分离度的影响,确定了较佳的分离条件:硅胶柱(250mm×4.6mmI.D.6μm);流动相:V(CO2):V(异丙醇)=99:1;流速:2mL/min;柱温:40℃;柱压程序:起始压力8MPa,以300kPa/min的速率升至12MPa;紫外检测波长:254nm;进样:2μL浓度为480mg/mL的α-紫罗兰酮与β-紫罗兰酮2个异构体的二氯甲烷溶液,此时,分离时间约10min,分离度达到3.3。     

HPLC法测定含乳饮料中烟酸和烟酰胺

本文建立了含乳饮料中烟酸和烟酰胺的高效液相色谱测定法.方法采用C18(5 μm,4.6 mm×250 mm i.d)反相色谱柱,流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;流动相V(甲醇)V(异丙醇)V(1.0 g/L辛烷磺酸钠水溶液)=7291,用60%高氯酸调pH2.50;进样量10 μL;检测波长261 nm.方法的检出1.0 mg/L,线性范围1.050.0 mg/L,加标回收率98.5%-105.3%,相对标准偏差为2.16%.该法具有样品预处理简单,灵敏度高,分析时间短等优点,可用于含乳饮料中烟酸和烟酰胺的直接测定.     

固相萃取-液相色谱法测定水果中的氨基甲酸酯与有机磷农药

建立了固相萃取-高效液相色谱同时测定水果中4种氨基甲酸酯与一种有机磷的方法.对提取溶剂、固相萃取柱种类、洗脱剂类型和用量及检测的色谱条件进行筛选和优化.样品经乙腈超声提取,弗罗里硅土固相萃取柱净化,净化后的样品采用液相色谱柱分离,以甲醇:水(体积比70∶ 30)为流动相,紫外检测波长为210nm,流速1.0mL/min...     

β-胡萝卜素异构体的定性分析

本研究发展并改进了以C30柱分离检测β-胡萝卜素异构体的高效液相色谱（HPLC）方法。在甲醇-MTBE-水（50：45：5,V/V/V）为流动相、检测波长为455nm、流速为1ml/min的色谱条件下,β-胡萝卜素熔融样品中至少有8种物质在10min内得到显著分离。借助液相色谱-大气压化学电离源质谱联用（HPLC-APCI-MS）法检测这8种物质被认为可能是β-胡萝卜素的异构体,通过比较它们的光谱特征和Q值,这些物质被依次鉴定为：15-顺-、13-顺-、9,15-双顺-、9,13-双顺-、全反式-、13,15-双顺-、9-顺-和9,13＇-双顺-β-胡萝卜素。