一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC—SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC—SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导,表达产物进行Ni^2＋-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a—EC—SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E．coli BL21（DE3）后,重组蛋白获得表达,Ni^2＋-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85％以上,经噻唑蓝（MTT）法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC—SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC—SOD3．凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

一种红色素对HeLa细胞体外生长的影响

本文研究青霉菌TA150301发酵产物类红曲色素的体外抗肿瘤作用。用倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖抑制率,荧光显微镜和流式细胞仪检测凋亡细胞,Western-blotting检测Caspase-3的表达。结果表明,HeLa细胞随着红色素浓度的升高,细胞凋亡形态较典型;MTT法显示:当红色素质量浓度为200mg/L时,HeLa细胞凋亡率为75.40%;添加红色素达200 mg/L,流式细胞术检测凋亡率为26.58%;与对照组相比,添加红色素使HeLa细胞Caspase-3表达水平上调。该红色素对HeLa细胞有良好的抑制效果,具有浓度依赖性。     

NF-κB和Caspase-3在金雀异黄素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用研究

采用MTT法、形态学观察和琼脂糖凝胶电泳法检测了金雀异黄素(genistein,Gen)对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞的生长和凋亡诱导作用,并采用免疫组化法和WesternBlot法检测Gen对人胃癌细胞NF-κB、Caspase-3蛋白的表达情况。结果显示:Gen可抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡,抑制NF-κB蛋白表达,增加Caspase-3蛋白表达。结果提示:Gen抑制NF-κB蛋白表达、增加Caspase-3蛋白表达,可能是其诱导胃癌细胞凋亡的机制之一。     

珠母贝糖胺聚糖PG-Ⅱ诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

目的:探讨珠母贝糖胺聚糖PG-II诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡,从而抑制其增殖。方法:MTT法检测珠母贝糖胺聚糖PG-II对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用。倒置显微镜、荧光显微镜观察HeLa细胞凋亡的形态学特征,琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂片段,流式细胞仪定量检测细胞凋亡的百分率及对其细胞周期的影响。结果:MTT法显示PG-II可抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖。倒置显微镜和荧光显微镜形态学观察可见HeLa细胞凋亡的形态明显变化。琼脂糖凝胶电泳显示PG-II作用HeLa细胞24h,出现分子质量为200bp到2000bp不等的细胞凋亡的特征性DNA梯状条带。流式细胞术测试表明:PG-II可使HeLa细胞阻滞于G1期,剂量为100mg/L作用24h阻滞作用最明显,凋亡指数为42.6%。结论:珠母贝糖胺聚糖PG-II可能通过诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡而抑制其增殖。     

卵叶娃儿藤生物碱对宫颈癌细胞株HeLa的体外作用

为了观察卵叶娃儿藤总生物碱[Tylophora ovata(Lindl.)Hook.ex Steud,alkaloids TOHa]体外抑制人宫颈癌细胞株HeLa增殖、诱导细胞凋亡的作用,将不同浓度的TOHa与HeLa细胞在体外培养,用MTT法观察TOHa对HeLa细胞的生长抑制作用,测定其在490nm的OD值;用细胞形态学、AnnexinV/PI双标记检测细胞凋亡。结果表明,TOHa能抑制HeLa细胞的增殖和活力,呈现作用时间和剂量的依赖关系。HeLa细胞经TOHa作用后,Annexin V /PI-表达升高,Giemsa染色后出现凋亡细胞的特征性改变。     

木枣多糖诱导胃癌细胞MKN-45凋亡的作用机制

研究木枣多糖(ZMP)诱导胃癌细胞MKN-45凋亡及其可能的作用机制。采用MTT法测定肿瘤细胞存活率,DAPI/AOEB染色观察肿瘤细胞形态,比色法测定肿瘤细胞乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)含量,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测细胞中抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Bax,Cyt-c和Caspase-3)的表达。结果表明:木枣多糖可诱导胃癌细胞MKN-45凋亡,其作用可能与降低肿瘤细胞的SOD活性,增加MDA、LDH的含量有关。通过提高Bax蛋白表达和降低Bcl-2蛋白表达,促进细胞色素C从线粒体释放到细胞质中,激活Caspase-3,最终通过线粒体调节的内源性凋亡通路诱导胃癌细胞MKN-45凋亡。     

松口蘑菌丝体蛋白质诱导细胞凋亡

采用深层发酵技术培养菌丝体并提取分离出的蛋白质,进行体外抗人子宫颈癌HeLa细胞增殖及诱导细胞凋亡机理的研究.试验发现松口蘑菌丝体水提液中活性蛋白质TMP在体外具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,扫描电镜观察到TMP处理细胞产生明显的凋亡小体,TMP对细胞周期的影响是通过抑制细胞从S到G2M期的转化来抑制HeLa细胞增殖,诱导细胞发生凋亡的.DNA电泳出现以200bp左右为单位的DNA碎片.结果表明采用液体培养方法生产的松口蘑菌丝体蛋白质,具有显著的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用.     

榆干离褶伞发酵液对血管内皮细胞的保护作用

为了探讨榆干离褶伞(Lyophyllum ulmarium,简写为LU)发酵液对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用,分别用20、40、80 mg/L LU干预HUVEC后用过氧化氢诱导凋亡,采用MTT法观察LU发酵液对细胞存活率的影响;通过比色法测定细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性;用流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测bcl-2、bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白质的表达。结果显示:LU发酵液显著提高内皮细胞的存活率,降低细胞上清液LDH活性,抑制H2O2诱导的细胞凋亡,降低bax、Caspase-3、Caspase-9的表达,提高bcl-2的表达。这说明LU发酵液对血管内皮细胞有保护作用,其机制可能与抑制凋亡有关。     

带有突变穿膜肽重组凋亡素可溶性表达的研究

目的构建apoptin（凋亡素）-HBDCK-pET28a突变体重组表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现高效可溶性表达,并观察突变后穿膜肽（CPP）在HeLa细胞中的转导活性。方法采用PCR介导突变方法将重组蛋白apoptin-HBD及EGFP-HBD的HBD结构域中的Cys（C）突变为Lys（K）。突变的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,Ni2＋-NTA亲和层析纯化目的蛋白,进一步观察HeLa细胞突变后HBD的转导活性。结果经双酶切鉴定和序列分析,突变后的重组质粒apoptin-HBDCK-pET28a及EGFP-HBDCK-pET28a构建正确。转化E.coli BL21（DE3）后,融合蛋白均获得可溶性表达。EGFP-HBDCK作用于HeLa细胞13 h后,可观察到细胞内强绿色荧光。结论 HBD结构域中C突变为K,可达到融合蛋白可溶性表达的目的,且仍能保持很强的转导活性,可携带EGFP蛋白进入HeLa细胞。     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽在大肠杆菌中的表达纯化及功能鉴定

本研究构建了编码重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽基因的原核表达载体pET28a-rhCⅠ,并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。采用PCR的方法扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的cDNA序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a上;重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。利用SDS-PAGE和WesternBlot检测表达产物。大量表达重组蛋白,采用镍亲和层析进行纯化,并对纯化后的蛋白进行体外抗氧化研究以及促细胞增殖分析。结果表明,通过大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达获得了分子量约为40ku的重组蛋白,与预期相符。经镍亲和层析获得纯度较高的蛋白,通过DPPH实验证明其有一定的抗氧化活性;而且MTT实验证实该蛋白可以促进小鼠成纤维细胞3T3细胞的增殖,为其在食品、化妆品和医疗行业的应用提供一定的理论依据。     

Nisin-rbLF-N融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

针对乳链菌肽(nisin)抑菌谱窄的缺点,选择对抗菌谱较广且具有较强抗性的牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)为材料,构建融合基因Nisin-rbLF-N。将融合基因克隆到原核表达载体pGEX-4T1 中,转化E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,将诱导表达的产物进行Tricine-SDS-PAGE 蛋白电泳及抑菌活性检测。结果表明,克隆菌经诱导后可表达出可观的融合蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在,包涵体经洗涤、尿素溶解、复性后具有抗菌生物活性。     

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.     

金黄色葡萄球菌M型肠毒素原核表达、纯化、鉴定及溶液构象分析

葡萄球菌肠毒素M是由金黄色葡萄球菌νSa基因岛编码的分泌型超抗原。本研究将截去N端信号肽的金黄色葡萄球菌M型肠毒素(staphylococcal?enterotoxin?M,SEM)蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-ΔNspsem;随后转化感受态E.coli?Rosetta(DE3)并探讨融合蛋白最佳表达条件;利用Ni2+-Sepharose?4?Fast?Flow亲合层析纯化出His-ΔNsp SEM融合蛋白;经质谱鉴定,纯化的融合蛋白对SEM的氨基酸覆盖率达96.3%;凝血酶切除6×His标签肽后,圆二色谱分析表明ΔNsp SEM重组蛋白富含β-折叠(35%)和β-转角(21%)以及较少α-螺旋(16%)等二级结构;荧光发射谱揭示ΔNsp SEM在278?nm和295?nm波长处激发时具有相同的Trp发射峰(341?nm);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析表明ΔNsp SEM重组蛋白表现出较高的热稳定性。研究结果表明重组蛋白SEM表达成功,纯化的ΔNsp SEM重组蛋白溶液构象紧密并具有接近天然状态的结构,这为深入研究SEM蛋白的结构与功能提供理论支持。     

河南华溪蟹金属硫蛋白分泌型表达载体的构建、表达及纯化

目的：构建河南华溪蟹金属硫蛋白（metallothionein,MT）分泌型表达载体并诱导其可溶表达。方法：采用基因重组技术,将河南华溪蟹MT基因亚克隆至碱性磷酸盐启动子（alkaline phosphatase promoter,phoA）分泌型原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过低磷酸盐诱导重组蛋白表达,经Ni2+螯合柱分离纯化后,利用紫外光谱扫描分析、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE）及Western blotting检测鉴定重组MT。结果：phoA-MT分泌型表达载体构建成功,工程菌经低磷酸盐诱导后重组MT以可溶形式获得表达,紫外光谱扫描和Western blotting证实表达产物的正确性,SDS-PAGE分析其纯度较高,主要以单体和二聚体的形式存在,其分子质量分别约为7.5、15 kD。结论：成功实现了河南华溪蟹MT的重组表达。     

丝胶抗冻肽在大肠杆菌中的重组表达及其抗冻活性初探

为了高效制备抗冻肽,研究一种丝胶抗冻肽目的基因SerD在大肠杆菌BL21菌株中的重组表达,并分析表达产物的抗冻活性。首先合成SerD基因片段,经KpnI和XhoI双酶切后定向插入质粒载体Pet32a中,构建表达质粒Pet32a-SerD,然后电转化入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的基因表达,利用镍琼脂糖亲和层析对目的重组蛋白进行纯化,并对其进行抗冻活性分析。结果表明,最佳表达条件为重组菌在20℃诱导16 h;通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹试验(Western-Blot)鉴定重组蛋白表达成功且His-SerD融合蛋白表达的分子量在25~35 kDa之间;胞内表达His-SerD融合蛋白的大肠杆菌BL21-SerD复苏后的生长活性明显高于PBL空载菌;添加His-SerD融合蛋白可明显降低溶液中冰晶颗粒大小,具有较好的重结晶抑制效果。本文通过基因工程方法在大肠杆菌中成功构建丝胶肽抗冻肽的重组表达系统,并最终获得具有抗冷冻胁迫保护作用的His-SerD融合蛋白。     

蓖麻毒素A链基因的克隆表达、纯化及其活性

为了实现蓖麻毒素A链基因(rta)的克隆表达,制备有高生物活性的重组蓖麻毒素A链蛋白(RTA),借助重组腺病毒介导表达的RTB进入细胞,发挥RTA的细胞毒作用,检测其活性。重组质粒pET32a-His-RTA能正确表达RTA融合蛋白,相对分子质量约47 000,每升细菌培养物回收约50 mg的纯化蛋白质,在有RTB表达的系列中,细胞死亡率明显上升,最高可达50%~60%。说明利用pET32a表达系统可以快速获得大量有高生物活性的可溶性RTA融合蛋白质。以腺病毒为载体表达RTB可以帮助RTA进入细胞,对细胞发挥毒性作用。