食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法的研究 Ⅰ肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌分离方法的研究

小肠结肠炎耶尔森氏菌是一个近年来引起食物中毒的新型菌,现已从许多种食品中分离到了该菌。近年来国内外多采用在4℃经7,14、21天冷增菌后,用 CIN 耶尔森氏菌选择性培养基来分离小肠结肠炎耶尔森氏菌,同时,对污染较严重的肉类食品,采用分离前用弱碱处理以破坏大量杂菌,提高该菌的检出率国内所见报道还多采用MAC,S S 这两种常用的肠道分离培养基,;也有报道用改良 Y 选择性培养基进行分离的。根据我国现有条件,我们改变了 CIN 培养基中的一些成分,命名为 CIN-I;比较小     

小肠结肠炎耶尔森氏菌分子生物学检测技术研究进展

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica,Y. enterocolitica）是一种重要的食源性致病菌,可以引起人类的耶尔森氏菌病,该病的典型症状为腹泻、回肠炎和肠系膜淋巴结炎等。由于该菌在特定食品（如肉与肉制品）中的检出率较高,因此对食品安全构成一定的威胁。就现有的检测方法而言,分离纯化和生理生化鉴定方法耗时且难以检测出复杂食品基质中低浓度的小肠结肠炎耶尔森氏菌。所以,研发能够快速、准确地检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴别方法迫在眉睫。该研究将小肠结肠炎耶尔森氏菌现有的分子生物学检测方法分为两大类：变温扩增技术和等温扩增技术进行相关研究最新进展的总结,并对其优缺点和发展方向进行讨论,以期为小肠结肠炎耶尔森氏菌快速检测方法研究提供参考。     

食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定方法研究进展

小肠结肠炎耶尔森氏菌是一种具有嗜冷特性的食源性致病菌,广泛存在于食品中,对人们健康构成较大威胁。建立高效的分离鉴定技术对该菌进行监控是相关食品安全的重要保障。本文对小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离过程,包括分离前增菌、分离前碱处理和平板分离,以及传统生化和血清型鉴定、分子生物学鉴定、免疫学鉴定和谱学鉴定方法等方面的研究进展进行了阐述。小肠结肠炎耶尔森氏菌的深入检测研究不仅有赖于现有分离鉴定方法的不断优化,还需要开发更多新型检测技术应用于菌株溯源分析、流行病学和耐药性等方面的研究,以期为该类菌株资源数据库的建立和整理,预防相关耶尔森氏菌疾病的爆发提供良好的保障。     

2018~2019年南昌市市售生鲜肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌污染情况分析

目的 了解南昌市生鲜肉品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的污染现状。方法 以市售的生鲜肉品(猪肉、牛肉和鸡肉)为研究对象,2018年8月～2019年7月期间每月从南昌地区当地超市和农贸市场累进行采样。样品经4 ℃冷增菌,划线CIN平板分离后,对可疑菌进行了生化鉴定。比较分析了不同采样场所、不同类型肉品以及不同采样时间小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出情况。结果 采集的480份样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的平均检出率为14.8%,来自超市的样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率高于农贸市场中的样品;猪肉、牛肉和鸡肉样品的阳性检出率分别为7.0%、18.8%和22.5%,其中猪肉和牛肉样品中污染率最高的均为调理肉;2018年12月～2019年4月采集的样品阳性检出率处在较高水平。结论 生鲜肉品中应重点关注整鸡、调理肉品中小肠结肠炎耶尔森氏菌污染风险,气温较低或低温贮藏的肉品中小肠结肠炎耶尔森氏菌污染风险较高。     

RF-LAMP技术检测鸡肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌

本研究建立实时荧光环介导等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定,表明扩增结果正确。本研究验证该方法特异性,对灵敏度和人工污染鸡肉的检出限进行测定。结果表明小肠结肠炎耶尔森氏菌株呈阳性结果,非小肠结肠炎耶尔森氏菌株均呈阴性结果。该方法检测纯菌的灵敏度为61 CFU/m L,人工污染鸡肉的检出限为46 CFU/g。该方法特异性强、灵敏度高、可实时检测小肠结肠炎耶尔森氏菌,能够实现对小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测。     

小肠结肠炎耶尔森菌前增菌方式的选择

小肠结肠炎耶尔森菌作为一种食源性致病菌逐渐引起了关注。本实验利用胰蛋白胨培养基、改良磷酸盐缓冲液和氯苯酚-替卡西林-氯酸钾培养基对小肠结肠炎耶尔森菌前增菌,并采用实时荧光PCR方法对增菌效果进行检验。结果表明：在纯菌体系中胰蛋白胨培养基对小肠结肠炎耶尔森菌的增菌作用优于其他两种培养基,并且增菌24h后即可检测到该菌。在混菌体系中小肠结肠炎耶尔森菌经过改良磷酸盐缓冲液增菌后灵敏性最高,并且增菌时间可缩短至8h。因此在实际检测中可采用改良磷酸盐缓冲液对该菌进行增菌检测。     

新等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌

应用新型等温扩增检测技术——交叉引物等温扩增结合免疫金标试纸条建立检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。针对小肠结肠耶尔森氏菌16-23S rDNA间区序列设计特异性引物及探针,用54株小肠结肠炎耶尔森氏菌及相近株细菌进行特异性试验;通过纯菌液计数、样品中添菌检测进行灵敏度验证;对677份食品用传统生化国标法进行比较检测试验。建立方法具有较好特异性;增菌液检测灵敏度为10~1cfu/mL,当每25g样品中有10~0cfu菌时经增菌步骤后即可检出,样品检测同传统检测结果比较大致相符,没有漏检,假阳性率较低。建立的新型恒温检测方法可用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌初筛检测。     

温州市食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌分布及分子分型研究

目的 了解温州市食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分子分型及分布特征。方法 4 ℃增菌后用选择性培养基对食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行分离鉴定,分析阳性菌株的生物型、血清型、毒力基因型、耐药性和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子型别。结果 采集6类食品,共676份样品,其中68份样品检出69株小肠结肠炎耶尔森氏菌,检出率为10.1%（68/676）。调理肉制品检出率最高（20.5%,9/44）,其次为速冻食品（17.2%,11/64）。95.7%（66/69）的分离株为生物1A型,生物血清型以1A/O∶5（29.0%）为主,其次为1A/O∶8（14.5%）;88.4%（61/69）的菌株仅携带ystB基因,检出1株4/O∶3型菌株携带毒力基因ail、ystA、yadA、virF。分离株对14种抗菌药物的敏感率达到94%以上。32株血清已分型菌株,分为29种PFGE带型。结论 温州市食品中存在一定程度的小肠结肠炎耶尔森氏菌污染,且检出致病性小肠结肠炎耶尔森菌,菌株耐药率处于较低水平,分子分型提示菌株呈高度遗传多态性。     

食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌污染调查和ERIC-PCR分型研究

通过调查全国17个城市中,七大类食品的小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yesinia enterocolitica)污染情况,了解其分布规律与遗传多样性,从而为我国食品中Y.enterocolitica污染的溯源和控制供相应的数据支持。本研究采用了稍作修改的《食品微生物学检验-小肠结肠炎耶尔森氏菌检验(GB/T 4789.8-2008)》和GB/T4789.8-2003两种方法对食品中Y.enterocolitica进行检测,同时运用ERIC-PCR技术对分离菌株进行分型研究。研究显示在946份食品样品中检出共50份Y.enterocolitica阳性样品,总污染率为5.29%。在检出的阳性样品中包括肉与肉制品24份、速冻食品25份和食用菌1份,污染率分别为12.06%、16.89%和0.74%,速冻食品和肉与肉制品是目前我国Y.enterocolitica污染的主要食品类型。采用GB/T4789.8-2008检出阳性样品25份,检出率为2.64%;采用GB/T4789.8-2003检出34份,检出率为3.59%明显高于GB/T4789.8-2008法。ERIC-PCR指纹图谱进行聚类分析,结果显示72个分离株可分为四簇,主要污染基因型在C簇,初步建立了Y.enterocolitica的ERIC-PCR指纹图谱数据库。     

巴氏杀菌对鲜乳中小肠结肠炎耶尔森氏菌的杀灭

前言小肠结肠炎耶尔森氏菌(以下简称耶氏菌),是近几年逐渐被人们认识,引起人类疾病的肠杆菌科细菌。它广泛存在于环境,自然界,动物和人类,能引起人的肠炎,败血症,污染食物后暴发食物中毒或肠道传染病。食品中污染这种细菌后对人们的健康有很大的潜在危险。为此,中华人民共和国食品卫生标准以法律条文规定该项菌的检验,以确保食品的质量和人群的健康。Denise Hughes1977年报告了从巴氏消毒乳中检出耶氏菌。为监测我市牛乳中该菌的污染情况,我们进行了牛乳中耶氏菌的检验,并从200份样品中分离出2株菌,其结果报告如下。     

速冻食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌污染状况及分析

速冻食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌污染状况及分析陈倩周国成吴桂红北京市卫生防疫站（１０００１３）小肠结肠炎耶尔森氏菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）广泛分布于自然界，为人畜共患病的病原菌之一，也是新近被引起注意的一种可引起食物中毒的病原菌...     

食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法

小肠结肠炎耶尔森氏菌广泛分布于自然界,是一种人畜共患的病原菌。耶氏菌对人的致病性早在1964年为Carlsson和Mollaret等氏所证实,本病临床表现多样,所致疾病涉及     

小肠结肠炎耶尔森氏菌PCR反应体系的快速优化

影响PCR反应结果的因素较为复杂．为了快速、准确地得到PCR反应的最适条件，避免假阴性或假阳性结果的发生，在研究小肠结肠炎耶尔森氏菌PCR反应体系优化中，采用了正交试验法．通过设计两组正交试验，准确地找出了检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的最佳扩增条件，结果表明该方法高效快速，是PCR反应体系优化中值得推广使用的方法。     

不同厂家小肠结肠炎耶尔森氏菌微量生化鉴定试剂盒的比对

评价本实验室研制的小肠结肠炎耶尔森氏菌微量生化鉴定试剂盒（简称EasyID）的使用性能。用36株菌（包括小肠结肠炎耶尔森氏菌2株标准株,19株分离株;弗氏耶尔森氏菌5株分离株;中间型耶尔森氏菌5株分离株;克氏耶尔森氏菌5株分离株）,测试EasyID,传统液态生化管（简称HKM）以及国内其他品牌（简称KIT）的三种鉴定试剂盒。结果表明：36株测试菌株的鉴定结果,EasyID、KIT两种干制鉴定试剂盒与HKM传统液态鉴定试剂盒鉴定结果相比总体符合率分别为99.69%、98.15%,EasyID相比KIT,与HKM的符合率更高;EasyID、HKM、KIT三种鉴定试剂盒与标准要求相比总体符合率分别为99.37%、99.07%、97.83%,EasyID符合率最高,HKM其次,KIT略低。结论：EasyID小肠结肠炎耶尔森氏菌微量生化鉴定试剂盒的可靠性优于KIT,与HKM相当。在使用方便性上,采用一步加样的技术的EasyID优于HKM和KIT。     

环介导等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究

采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。以小肠结肠炎耶尔森氏菌(AY004311.1)Ail基因序列作为靶序列,设计内、外引物,通过肉眼观察沉淀判断检测结果。结果表明:LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度为6.3cfu/mL,人工污染鸡肉的检出限为340cfu/g。PCR检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度为630cfu/mL,人工污染鸡肉的检出限为3.4×104cfu/g。采用试剂盒法提取DNA,从样品处理到报告结果,LAMP方法耗时2h,PCR方法耗时3h。因此,LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度高,耗时短,特异性好,操作简便,无需特殊的仪器设备,适合在我国广大基层实验室开展应用,为快速检测食源性致病菌构建了一个新的技术平台。     

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光RPA检测方法的建立

本研究建立了致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-timeRecombinasePolymerase Amplification,real-time RPA)检测方法。根据致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌黏附侵袭位点ail致病基因序列设计特异性引物和exo探针,在37℃恒温下20 min内即可完成检测,方法特异性高,对目的 DNA的检测限为0.1 ng/μL。在稳定性实验中,对10 ng/μL、0.1ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL的目的 DNA各进行8个平行的测试,0.1 ng/μL及以上浓度的DNA均可稳定检出;当DNA为0.1 ng/μL时,8个平行的阈值时间和最大荧光值的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)最低且≤7.06%。致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌在奶粉和牛肉的人工污染样品中初始污染量为3 CFU/25 g时,培养20 h后,可用本方法检出。对20份各种类实际样品进行检测,本方法与国标方法结果一致。本方法对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的常温现场快速定性检测具有重要意义。     

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光RPA检测方法的建立

本研究建立了致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-timeRecombinasePolymerase Amplification,real-time RPA)检测方法。根据致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌黏附侵袭位点ail致病基因序列设计特异性引物和exo探针,在37℃恒温下20 min内即可完成检测,方法特异性高,对目的DNA的检测限为0.1 ng/μL。在稳定性实验中,对10 ng/μL、0.1ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL的目的DNA各进行8个平行的测试,0.1 ng/μL及以上浓度的DNA均可稳定检出;当DNA为0.1 ng/μL时,8个平行的阈值时间和最大荧光值的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)最低且≤7.06%。致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌在奶粉和牛肉的人工污染样品中初始污染量为3 CFU/25 g时,培养20 h后,可用本方法检出。对20份各种类实际样品进行检测,本方法与国标方法结果一致。本方法对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的常温现场快速定性检测具有重要意义。     

辅酶Q0对小肠结肠炎耶尔森氏菌的抑杀作用及对菌体细胞膜的影响

小肠结肠炎耶尔森氏菌是一种广泛分布于蔬菜、乳制品、肉类、豆制品和沙拉中的食源性致病菌，该菌引起的耶尔森氏菌病属于较严重的人畜共患病，对公共卫生构成重大威胁。本文探究辅酶Q0对小肠结肠炎耶尔森氏菌的抑杀作用及对菌体细胞膜的影响，利用液体稀释法测定辅酶Q0对小肠结肠炎耶尔森氏菌的最小抑菌浓度(MIC)，随后，依据MIC的试验结果测定最小杀菌浓度(MBC)，以及对菌体生长曲线的影响，通过检测辅酶Q0对小肠结肠炎耶尔森氏菌在LB介质中的抑杀作用，评价其抑菌效果。通过测定辅酶Q0对小肠结肠炎耶尔森氏菌膜电位、胞内ATP浓度、细胞膜完整性以及菌体细胞形态的影响，探究其对菌体细胞膜的影响。试验测得辅酶Q0对小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715的MIC和MBC均为0.10 mg/mL，辅酶Q0作用后使菌体生长延滞期延长，最大生长速率减小。探究辅酶Q0的抑杀作用，发现当辅酶Q0质量浓度为MIC时，细菌总数于6 h后降至检出限以下；当质量浓度为2 MIC时，细菌总数于3 h后降至检出限以下。辅酶Q0处理使菌体细胞膜电位显示超极化，胞内ATP浓度降低，细胞膜完整性降低，细胞形态出现凹陷、皱缩现象，表明菌体细胞膜完整性和通透性发生改变。本研究结果表明:辅酶Q0对小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715表现出良好的抑杀效果，其抑菌作用通过影响细胞膜的完整性和通透性实现，研究结果为辅酶Q0用于食品工业中控制小肠结肠炎耶尔森氏菌提供理论依据。     

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定及三重PCR检测方法的建立

为鉴定导致患病鲫鱼肛门红肿、腹部有出血点症状的病原菌,并建立一种快速检测该病原菌的方法。本研究从患病鲫鱼中分离了病原菌,采用形态学、理化特性分析及16S rDNA序列分析方法鉴定菌株。采用PCR扩增法检测该菌毒力基因,琼脂纸片扩散法检测该菌株的耐药性,致病性能验证试验检测其致病性。针对该菌ail基因、inv基因和intB基因设计了3条特异性引物,通过对反应体系和条件的优化,建立了一种检测该菌的三重PCR方法并初步应用于患病鲫鱼样品的检测中。结果显示,从患病鲫鱼心脏组织中分离了一株小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）,命名为fsznc-10。检测到该菌携带ail、ystB、virF、intB毒力基因,该菌对诺氟沙星、庆大霉素等5种抗生素敏感,对鲫鱼具有一定的致病性。三重PCR方法可准确扩增出小肠结肠炎耶尔森氏菌ail、inv和intB三个目的基因,而其他菌株均未扩增出目的基因。该方法检测该菌DNA最低检出量为1.704×10?6 ng/μL,检测患病鱼心脏样品的阳性率约为86.67%,与16S rDNA序列分析方法的检测符合率为100%。本试验建立的三重PCR检测法具有特异性强、敏感性高、操作简单、成本低的优点。这为临床中小肠结肠炎耶尔森氏菌的防控和检测提供参考依据。     

核酸试纸条法检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌

建立一种基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试纸条技术的快速检测小肠结肠炎耶尔森菌的检测方法。对26株小肠结肠炎耶尔森氏菌标准菌株及26株其他菌属标准菌株进行特异性试验,利用纯菌稀释及样品添加进行灵敏度试验。利用建立方法对市场购买的食品进行筛查并与国标方法进行比较。建立的方法 DNA检测灵敏度达到10~(-3)μg/mL,样品加菌试验检测灵敏度可达100 CFU/25 g。