猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件:95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%².81%,试验间CV为1.23%2.81%,试验间CV为1.23%².21%,均<5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。     

羧甲基壳聚糖病毒灭活/去除工艺验证

目的对羧甲基壳聚糖病毒灭活/去除工艺进行验证。方法模拟生产条件,选择猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、伪狂犬病病毒(pseudo rabies virus,PRV)、鸭肝炎病毒Ⅰ型(duck hepatitis virus-Ⅰ,DHV-Ⅰ)、牛滤过性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)作为指示病毒,采用高温碱化和醇洗灭活/去除病毒,Karber法计算病毒滴度,荧光PCR检测病毒灭活/去除效果。结果 3批甲壳素经碱化反应处理,PRV、PPV、BVDV、DHV-Ⅰ的平均灭活对数值分别为≥6.736、≥6.597、≥6.138和≥5.806 log TCID50/0.1 ml;3批羧甲基壳聚糖经醇洗处理,PRV、PPV、BVDV、DHV-Ⅰ的平均灭活对数值分别为≥6.763、≥6.569、≥6.167和≥5.587 log TCID50/0.1 ml。碱化反应与醇洗处理前感染PRV、PPV、BVDV、DHV-Ⅰ样品荧光PCR检测平均Ct值分别为23.465、23.387,24.873、24.706,26.887、25.376,27.386、24.629,处理后样品的荧光PCR检测平均Ct值均40。结论羧甲基壳聚糖经高温碱化和醇洗反应处理均能有效灭活病毒,保证了产品的安全性。     

猪瘟和猪蓝耳病病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和猪蓝耳病病毒(Porcine respiratory and reproductivesyndrome virus,PRRSV)多重RT-PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的CSFV和PRRSV疫苗株基因组序列,分别设计针对CSFV和PRRSV的两对引物,建立多重RT-PCR检测方法,并进行敏感性及特异性验证。用建立的多重RT-PCR法检测20份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料,并与市售RT-PCR试剂盒的检测结果进行比较;检测病料的部分PCR产物测序后,与9株具有代表性的CSFV毒株和10株具有代表性的PRRSV毒株进行核苷酸序列同源性比对。结果以CSFV和PRRSV混合引物扩增,分别可扩增出286和664 bp的特异性条带。建立的多重RT-PCR检测方法可检出100倍稀释的病毒RNA;该方法可检出CSFV、PRRSV及CSFV与PRRSV混合病毒,而猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Trans-missible gastro-enteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)的检测结果均为阴性;该方法检测20份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料的结果与市售RT-PCR试剂盒比较,灵敏度达100%;选取的两份CSFV扩增片段与9株具有代表性的CSFV毒株的核苷酸序列同源性在92.3%⁹8.2%之间,扩增的PRRSV与10株具有代表性的PRRSV毒株的核苷酸序列同源性在94.1%98.2%之间,扩增的PRRSV与10株具有代表性的PRRSV毒株的核苷酸序列同源性在94.1%⁹7.9%之间。结论成功建立了CSFV和PRRSV多重RT-PCR检测方法,为猪瘟和猪蓝耳病的早期诊断及流行病学调查奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。     

S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ制品中猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒灭活效果的验证

目的验证S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品中猪伪狂犬病病毒(pesdorabies virus,PRV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活效果。方法以PRV和PPV为指示病毒,模拟FⅧ生产工艺中的S/D及干热病毒灭活工艺,采用96孔板微量细胞病变法检测3批FⅧ半成品的残留病毒滴度。结果批号为201203002、2012-04003、201204004 3批FⅧ半成品经(25±1)℃S/D灭活处理15 min后,PRV滴度分别下降≥6.5、≥6.8、≥6.8 lg TCID50/0.1 ml;经(100±2)℃干热灭活30 min后,PPV滴度分别下降4.00、3.92、3.94 lg TCID50/0.1 ml。结论 S/D法及干热法分别对FⅧ制品中PRV和PPV具有良好的灭活效果,本实验为凝血因子类制品的病毒灭活验证工艺的研究奠定了基础。     

人偏肺病毒检测方法的比较

目的比较几种人偏肺病毒(hMPV)的检测方法,为临床选择适当的检测方法提供依据。方法不同稀释度的hMPV分别感染Vero-E6细胞,出现细胞病变(CPE)后,分别用RT-PCR、Real-time PCR和IFA进行检测,比较3种方法的灵敏度;10倍系列稀释滴度为105.2TCID50/ml的hMPV,分别用RT-PCR及Real-time PCR进行检测,定量比较两种方法的灵敏度;分别用Real-time PCR和IFA检测523份急性呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物。结果IFA、RT-PCR和Real-time PCR分别可检出10-4、10-5、10-7稀释度孔中的病毒;RT-PCR和Real-time PCR检测的灵敏度分别为1.0×103和1TCID50/ml;在523份鼻咽分泌物标本中,IFA检测阳性率为9.18%,Real-time PCR检测阳性率为31.55%。结论Real-time PCR检测鼻咽分泌物标本中hMPV为儿科临床早期诊断的最佳方法;IFA可作为基层医院及hMPV相关严重呼吸道感染的检测方法。     

钴~(60)-γ射线辐照法对骨蜡中指示病毒灭活效果的验证

目的验证钴60-γ射线辐照对骨蜡中模拟污染指示病毒的灭活效果。方法将固体骨蜡制成腔壁0.7 cm厚的空心圆柱体的辐照用样品,空腔中分别加入6.61 Lg PFU/ml辛德毕(Sindbis)病毒、7.07 LgTCID50/0.1 ml脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)和6.01 LgTCID50/0.1 ml猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),分别经5、10、15、20及25 kGy的钴60-γ射线进行辐照后,收集样品腔中的病毒液,采用噬斑形成法检测Sindbis病毒滴度,采用微量半数细胞病变法检测PPV和EMCV滴度。结果经不同剂量kGy钴60-γ射线辐照,Sindbis病毒、EMCV及PPV的病毒滴度随辐照剂量的增加而下降,辐照剂量增加至25 kGy时,可灭活3种病毒的量分别达6.03⁶.60 LgPFU/ml、6.256.60 LgPFU/ml、6.25⁶.32 Lg TCID50/0.1 ml和4.756.32 Lg TCID50/0.1 ml和4.75⁴.88 LgTCID50/0.1 ml以上。结论 25 kGy的钴60-γ射线对骨蜡中的包膜和无包膜病毒均有较好的灭活效果。     

鸭瘟病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立鸭瘟病毒PCR检测方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的鸭瘟病毒基因(UL30、UL31)序列,设计合成1对特异性引物,以鸡胚化弱毒疫苗株病毒基因组DNA为模板,进行PCR扩增。优化PCR的反应条件,并对方法的敏感性、特异性及适用性进行验证。结果经PCR可扩增得到446 bp的目的基因条带,测序结果与已发表的序列同源性达100%。该方法的最低检出限为2.1 pg,对7种鸭易感性病原体及3种鸭瘟病毒同类病原体的检测结果均为阴性。结论已建立了敏感、特异、快速的鸭瘟病毒PCR检测方法。     

长春地区猪十二指肠贾第鞭毛虫感染的分子流行病学调查

目的调查长春地区猪十二指肠贾第鞭毛虫(简称贾第虫)感染的分子流行病学特征。方法选择长春地区两个猪场,随机采集60份猪粪便样品,根据贾第虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,TPI)基因设计巢式PCR引物,以提取的猪粪便基因组DNA为模板进行巢式PCR扩增,PCR产物经测序及序列比对,并建立贾第虫系统进化树。结果 60份样品中,27份为阳性,阳性率为45%(27/60),基因型均为人兽共患型集聚体A。结论长春地区两个猪场存在较严重的贾第虫感染,基因型均为集聚体A,有较大的散播风险,需加强猪场卫生监督管理,以避免疫病流行。     

乙型肝炎病毒X基因DNA竞争子的构建及鉴定

目的构建乙型肝炎病毒X基因DNA(xDNA)竞争子L180,为竞争PCR定量分析xDNA打下基础。方法以扩增的xDNA片段为模板,用引物1434和Lx PCR扩增竞争子DNA,并将扩增产物克隆到pUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,酶切鉴定和测序,筛选阳性竞争子质粒,并建立竞争PCR定量分析xDNA的方法。结果所构建xDNA竞争子L180,经测序及PCR定量分析证实,PCR扩增的产物即为目的xDNA。初步建立了竞争PCR定量分析xDNA的方法。结论已成功构建乙肝病毒xDNA竞争子。     

鼬獾狂犬病病毒分离株的培养及其免疫原性

目的对分离的鼬獾狂犬病病毒BHK-21细胞适应株进行毒力和免疫原性检测,为兽用狂犬病疫苗的生产奠定基础。方法将分离获得的鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在BHK-21细胞上连续传代,采用直接免疫荧光法测定病毒滴度(TCID50);PCR法检测外源病毒和支原体。以β-丙内酯灭活病毒液,将灭活的病毒液免疫犬,采用FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体水平,分析其免疫原性。结果鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在体外培养至130代时,病毒滴度可达1.0×107.75 TCID50/ml;未从狂犬病病毒JX08-45株中扩增出犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、腺病毒和支原体的特异性核酸;灭活的病毒液接种犬后产生的中和抗体可持续1年以上,且均在0.5 IU/ml以上。结论鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45经BHK-21细胞传代适应性较好,病毒滴度较高,且具有较好的免疫原性,已具备制备疫苗的基本条件。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒种(SA14-14-2株)及其疫苗的表型和E基因稳定性研究

目的　对乙脑减毒活疫苗SA14 14 2株生产毒种及其疫苗病毒滴度、脑内毒力和E区核苷酸序列进行回顾性测定。方法　应用乳金黄地鼠肾传代细胞 (BHK 2 1)结晶紫蚀斑法进行病毒滴度的测定 ,小鼠脑内法检测疫苗脑内毒力。应用RT PCR方法扩增SA14 14 2生产毒种和疫苗E区的核苷酸 ,经凝胶层析纯化的PCR产物直接用于测序或克隆到pGEM T载体中 ,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果　疫苗在 - 2 0℃保存长达 10多年 ,疫苗病毒滴度下降不超过 0 5lg;脑内毒力未见毒力回升。病毒蚀斑形态仍保持较SA14野毒株形态小的特性 ;以不同批次疫苗和生产毒种提取的病毒RNA作为模板进行RT PCR扩增 ,扩增的基因片段与预期大小一致 ;E区基因序列与野毒株差异的 8个氨基酸没有一个发生回复突变。结论　SA14 14 2生产毒种及其不同年度不同批次疫苗的生物表型和E区核苷酸的特性是十分稳定的     

终端干热法灭活凝血因子类制品中细小病毒的工艺验证

目的验证终端干热法灭活凝血因子类制品中细小病毒的灭活工艺,并对其灭活效果进行评价。方法以猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)为指示病毒,模拟凝血因子类制品生产工艺中病毒灭活的工艺,采用96孔板微量细胞病变法检测残余病毒滴度,验证终端干热法灭活病毒的效果。结果 3家企业生产的人凝血因子Ⅷ制品经100℃加热30min灭活,病毒滴度分别下降2.01～2.31、≥3.92和3.13～3.50LgTCID50/0.1ml;冻干与加热联合作用,病毒滴度分别下降2.82～3.00、≥4.24和4.00～4.12LgTCID50/0.1ml;5家企业生产的人纤维蛋白原经100℃加热30min灭活,病毒滴度分别下降3.50～3.63、2.56～2.70、3.06～3.57、3.00～3.25和≥3.75LgTCID50/0.1ml;冻干与加热联合作用,病毒滴度分别下降4.00～4.12、3.12～3.46、4.04～4.56、3.50～3.75和≥4.63LgTCID50/0.1ml。结论终端干热法对凝血因子类制品中的细小病毒具有一定的灭活作用,但由于工艺复杂、影响因素较多,不同企业生产的同类制品的病毒灭活效果不尽相同。     

犬细小病毒VP2蛋白重组人5型腺病毒的构建

目的构建犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白重组人5型腺病毒。方法将从CPV中PCR扩增的VP2基因克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA中,经酶切及测序鉴定,将构建正确的重组穿梭质粒pacAd5-cVP2与骨架质粒pacAd5 9.2-100经PacⅠ酶切线性化,共转染293AD细胞,进行同源重组,包装出重组腺病毒rAd5v-cVP2,按Karber法计算重组腺病毒的病毒滴度(TCID50)。电镜下观察重组腺病毒的形态;RT-PCR及Western blot法检测CPV VP2基因mRNA的转录及蛋白的表达水平。结果重组穿梭质粒pacAd5-cVP2经酶切及测序证明构建正确;包装出的重组腺病毒rAd5v-cVP2的病毒滴度可稳定在108.25TCID50/ml;电镜下观察可见典型的腺病毒外型特征;重组腺病毒感染的293AD细胞可检测到VP2基因的转录和表达。结论已成功构建了CPV VP2蛋白重组人5型腺病毒。     

水痘-带状疱疹病毒gE糖蛋白基因扩增法鉴别水痘减毒活疫苗

目的利用水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE糖蛋白基因鉴别水痘减毒活疫苗。方法以提取的病毒DNA为模板,PCR扩增gE糖蛋白基因。经琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果水痘减毒活疫苗Oka株VZV(病毒滴度≥2.0lgPFU/ml)通过琼脂糖电泳均可见特异性的条带。使用同样的方法检测麻疹减毒活疫苗、麻疹-腮腺炎联合疫苗、风疹减毒活疫苗以及Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒(病毒滴度≥4.2lgCCID50/ml),结果均为阴性。结论gE糖蛋白基因可以作为VZV的特异性指标,进行病毒鉴别试验。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株与临床分离株可变区基因的序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)Oka株(V-Oka株)与分离于临床水痘患者的野毒株进行可变区基因序列比对分析。方法提取V-Oka株和VZV临床分离株的基因组DNA,对其串联重复序列区(R区)进行PCR扩增和测序;将R3基因的纯化产物与pMD18-T载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,提取质粒,经双酶切鉴定及测序;将测序结果与GenBank中登录的V-Oka株基因序列进行比对分析。结果 R1～R5基因扩增产物及R3基因重组质粒的双酶切产物片段大小均与预期相符;V-Oka株较稳定,测序结果与GenBank中登录的V-Oka株R1～R5基因序列一致,野毒株R区序列呈现多态性,与V-Oka株有差异,R4区序列区别明显。结论水痘患者的致病毒株为野毒株;R4的重复单位拷贝数可为临床快速鉴别V-Oka株与野毒株提供科学的手段。     

H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定。方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdua(lpFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达。结果重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-M1经PCR鉴定证实构建正确;第3代rBac-M1病毒滴度为3×108pfu/ml;感染rBac-M1的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。结论已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法的建立

目的建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法。方法根据高致病性PRRSV Nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株(非缺失株)的核苷酸序列,设计扩增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失区域的Nsp2基因片段的二重PCR引物,并设计长度为31～35nt的美洲型毒株通用寡核苷酸探针和非缺失株相对于变异株Nsp2基因缺失区域的探针,建立寡核苷酸芯片方法。检测该方法的特异性和灵敏度,并进行初步应用。结果通过杂交模式可清楚地区分经典毒株与缺失毒株;芯片探针与猪瘟病毒(Clas-sical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)样品无非特异性杂交;芯片法与常规PCR法的灵敏度相近;对12份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果与常规PCR法一致。结论建立的芯片方法能够准确鉴别高致病性PRRSV Nsp2缺失变异株,可用于高致病性PRRSV的临床诊断和流行病学调查。