用Bubble PCR法对一个新的锌指基因进行外显子划界

介绍了一种确定基因外显子－内含子交界点的快速、准确的方法，应用该方法对本室克隆的一个新的锌指基因ＺＮＦ１９１进行了外显子划界。将含有ＺＮＦ１９１全长ｃＤＮＡ的基因组ＤＮＡ经限制酶酶切后与退火的Ｂｕｂｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ连接，以该连接产物为模板，用依据ｃＤＮＡ序列设计的引物和Ｂｕｂｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ上的特异引物进行ＰＣＲ扩增，继以相同的扩增条件对扩增产物进行测序，从而确定了外显子－内含子的交界点。     

小麦品种“Lee”中抗条锈病基因的RAPD标记

共用３８０个１０碱基随机引物，对抗条锈病基因ＹｒＬｅｅ的近等基因系进行了ＲＡＰＤ分析，其中有两个引物在抗病的近等基因系ＹｒＬｅｅ／６＊Ｔａｉｃｈｕｎｇ２９Ｆ３和基因供体亲本“Ｌｅｅ”中扩增出了特异的ＤＮＡ片段，而在轮回亲本“Ｔａｉｃｈｕｎｇ２９”中没有扩增出同样的ＤＮＡ片段，引物ＯＰＲ－７扩增出的ＤＮＡ片段长度约为４６５ｂｐ，引物ＯＰＲ－９扩增出的ＤＮＡ片段长度约国６６７ｂｐ。用基因供体亲本“Ｌｅ     

小麦品种“Lee”中抗条锈病基因的 PAPD 标记

共用３８０个１０碱基随机引物，对抗条锈病基因ＹｒＬｅｅ的近等基因系进行了ＲＡＰＤ分析，其中有两个引物在抗病的近等基因系ＹｒＬｅｅ／６＊Ｔａｉｃｈｕｎｇ２９Ｆ３和基因供体亲本“Ｌｅｅ”中扩增出了特异的ＤＮＡ片段，而在轮回亲本“Ｔａｉｃｈｕｎｇ２９”中没有扩增出同样的ＤＮＡ片段。引物ＯＰＲ－７扩增出的ＤＮＡ片段长度约为４６５ｂｐ，引物ＯＰＲ－９扩增出的ＤＮＡ片段长度约为６６７ｂｐ。用基因供体亲本“Ｌｅｅ”与感病品种“铭贤１６９”杂交的Ｆ２代分离群体（１８９株植株）进行的遗传连锁性分析表明，引物ＯＰＲ－７扩增出的特异ＤＮＡ片段与ＹｒＬｅｅ基因紧密连锁。     

热休克后表达受抑基因的mRNA差别显示和克隆

以人成骨肉瘤细胞株（ＨＯＳ－８６０３）作为热休克模型，用差别显示ｍＲＮＡ法（ｄｄｍＲＮＡ）筛选，发现和克隆了一个热休克后表达受抑的ｃＤＮＡ片段。在４３℃、４０分钟热处理后１小时，ＨＯＳ－８６０３细胞总ｃＤＮＡ图谱未见明显变化，但以该ｃＤＮＡ片段作为探针，ＲＮＡｄｏｔｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实，热休克后该基因的ｍＲＮＡ的量明显下降，而ｍＲＮＡ未见明显降解。我们将这个因热休克而选择性的表达受抑的基因命名为ＨＳＳＧ－１。对全长３１２ｂＰ的ｃＤＮＡ片段的序列分析表明，ＨＳＳＧ－１可能是一个未知的新基因。     

人羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG—CoA）还原酶催化域在大肠杆菌中的表达及…

参照１９９３年Ｆｒｉｍｐｏｎｇ等表达仓鼠同源酶催化域研究结果，将ＰＣＲ法制备的人ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶催化域ｃＤＮＡ克隆入表达载体ｐＥＴ３０，使表达产物Ｃ端融合载体编码的Ｈｉｓ－Ｔａｇ，以利产物的稳定和完整产物的纯化。     

中国人IL－9cDNA的亚克隆及其高效表达

在完成了ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的克隆及序列测定的基础上，为实现ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ在原核细胞中的表达，重新合成了上游引物（在酶切位，久后加上ＡＴＧ）。以ｐｕｃ１９－ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，特异产物经ＥｃｏＲＩ酶切、回收后与经ｓｍａｌＩ、ＥｃｏＲＩ酶切的ｐＢｖ２２０载体连接，转化大肠杆菌。转化子质粒用０．８％ａｇａｒｏｓｅ电泳粗筛，经ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ酶切后得到了３个阳性克隆。３个阳性克隆经热诱导后，在ＰａＰ＿Ｌ启动子作用下，获得了天然ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的高效表达，表达量分别达到可溶性总蛋白的３７．３％、４３．８２％、５４．５２％。     

一个编码XPA2同源蛋白的人视网膜cDNA的克隆

用同源筛选法从人视网膜ＣＤＮＡ分子库中克隆到一个与ＸＡＰＣＤＮＡ有高度同泊的ＣＤＮＡ序列,长１３８６ｂｐ,其第一１７－１１７１ｎｔ为一个完整的开放阅读框（ＲＯＦ）,编码３８４个氨基酸,其Ｃ端较ＸＡＰ２长５５个氨基酸,３’ＵＴＲ长２１８ｂｐ１３５５－１３６０ｎｔ为加尾信号序列ＡＡＴＡＡＡ,１３７７－１３８６ｎｔ为ＰｏｌｙＡ序列。由该ＣＤＮＡＯＲＦ推导的蛋白质被命名为ＡＩＰＨ,它在ＧｅｎＢａｎｋ的登录     

与大豆孢囊线虫病性相关的PAPD标记

利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术，对７个抗大豆孢囊线虫的大豆和１０个感病大豆品种的基因组ＤＮＡ进行了ＲＡＰＤ分析，供试的２００个随机引物均产生了清晰稳定的ＲＡＰＤ扩增产物，其中有２１个随机引物产生的ＲＡＰＤ扩增产物具有多态性，获得了５个与大豆孢囊线虫病抗性相关的ＤＮＡ片段，这些ＲＡＰＤ标记具有较高的重复性和稳定性，可辅助抗大豆孢囊线虫病大新品种的选育。     

与大豆孢囊线虫病抗性相关的RAPD标记

利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术，对７个抗大豆孢囊线虫的大豆材料和１０个感病大豆品种的基因组ＤＮＡ进行了ＲＡＰＤ分析，供试的２００个随机引物均产生了清晰稳定的ＲＡＰＤ扩增产物，其中有２１个随机引物产生的ＲＡＰＤ扩增产物具有多态性。获得了５个与大豆孢囊线虫病抗性相关的ＤＮＡ片段，这些ＲＡＰＤ标记具有较高的重复性和稳定性，可辅助抗大豆孢囊线虫病大豆新品种的选育。     

运用一步化体外转录—翻译系统筛查基因突变的新技术

报道了一种筛查基因突变的新技术－ＰＣＲ结合一步化体外转转录－翻译系统。该技术包括：（１）ＰＣＲ扩增靶ＤＮＡ片段，并使ＤＮＡ产物的一端或两端带上Ｔ７Ｔ１序列；（Ｔ１：翻译起始信号，ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧ）；（２）以核的为模板，利用一步化体外转录－翻译系统合成相应肽链；（３）用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及高分辨ｐＨ梯度ＰＡＧＥ（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离分析多肽产物，通过异常电泳图谱而发现基因突变，本文以已知突变的     

快速cDNA文库筛选和淀粉合成酶基因的分离与鉴定

建立了一种以PCR为基础的快速筛选cDNA文库的方法。该方法利用96孔板和一对特异的引物,逐级从cDNA文加筛选目标克隆,最终获得目标DNA片段。与同位素杂交筛选方法相比,该方法具有快速、简单、省时等优点,数日内即完成目标片段的克隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳37未成熟种子的cDNA文加筛选出了完整的水稻可溶性淀偻合酶基因cDNA序列。我们认为此方法对于筛选其他类型文库同样有借鉴意义。     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。     

牙鲆自然杀伤细胞增强因子(NKEF)全长cDNA的克隆及表达分析

采用快速扩增cDNA末端（rapid amplification of cDNA ends,RACE）的方法,分离和测定了牙鲆自然杀伤细胞增强因子（NKEF）cDNA的全长核苷酸序列,5’RACE扩增分离得到了400bp左右的片段,3’RACE扩增得到了800bp左右的片段,经过拼接得到了牙鲆NKEF全长cDNA序列。牙鲆NKEF cDNA全长1028bp（不包含polyA）,其中包括67bp的5’非翻译区、597bp的开放阅读框和364bp的3’非翻译区（不包含polyA）,整个开放阅读框编码198个氨基酸。RT—PCR分析表明,NKEF基因在牙鲆不同组织中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。研究结果为提高牙鲆自身免疫防御能力的研究提供了理论依据。     

不同对虾种间共用微卫星DNA引物的研究

采用已发表的斑节对虾的30对微卫星引物,对部分微卫星引物在中国对虾、凡纳对虾、日本对虾中的通用性进行了研究。通过所建立的降温PCR(Touchdown PCR)方法对3种对虾的DNA进行PCR扩增,筛选出3对引物在3种对虾中均能产生清晰谱带。根据上述结果适当调整PCR反应体系中各试剂的量及反应条件,达到了理想的结果。利用这3对引物对3种对虾进行遗传标记分析,结果显示,PCR扩增产物条带清晰,特异性强,每对引物在3种对虾间扩增出的特异性片段大小几乎一致。研究表明,3种对虾基因组间存在一定程度的相似性,引物W15-16、W21-22和W45-46可直接应用于中国对虾、凡纳对虾、日本对虾、斑节对虾分子标记的基因组比较作图,也为图谱克隆法提供了新的思路。     

番杏Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析

根据同源序列设计筒并引物,通过RT—PCR及RACE的方法从盐生植物番杏中克隆出Na^ ／H^ 逆向运输蛋白基因。序列分析表明,该cDNA全长2199bp,开放读码框为1665bp,可编码一个554个氨基酸的多肽,与其他植物中已经克隆的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(TtNHX1)与液泡型的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白的亲缘较近,与质膜型的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。TtNHX1的表达具有组织特异性,在番杏的根、茎和叶中均有表达,而花中没有表达。经NaCl诱导后根、茎和叶中的表达量增加,而花中仍没有表达。     

海湾扇贝g型溶菌酶基因cDNA的克隆与分析

通过EST和锚定PCR技术,从海湾扇贝(Argopecten irradians)中克隆得到一种溶菌酶基因的全长cDNA(全长659bp,编码200个氨基酸)。BLASTx分析的结果显示,它和脊椎动物g型溶菌酶相似性较高,却不同于无脊椎动物中已发现的c型和i型溶菌酶。在其编码的氨基酸序列中发现了g型溶菌酶的活性中心(Glu82,Asp97,Asp108),同时6个保守的半胱氨酸也与鸟类和鱼类的g型溶菌酶相一致。结合BLASTX分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是一种在无脊椎动物中首次发现的g型溶菌酶的编码序列。采用Clustalw软件,对多种脊椎动物c型、g型溶菌酶和无脊椎动物c型、i型溶菌酶以及本研究发现的无脊椎动物g型溶菌酶进行了分析,结果发现,无脊椎动物c型、i型溶菌酶和脊椎动物c型溶菌酶同源性较高,而海湾扇贝g型溶菌酶和脊椎动物g型溶菌酶同源性较高。由此说明c型、g型溶菌酶从无脊椎到脊椎动物的进化是平行发生的,这对进一步研究溶菌酶及其分子进化具有重要意义。     

灭活病毒诱导牙鲆传代细胞差减cDNA文库的构建及分析

以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR扩增后,取正向差减的PCR产物与T载体连接,构建抑制差减cDNA文库,随机挑取7400余个克隆,对其中4200多个克隆进行PCR扩增鉴定,发现近4000个克隆中均含有插入片段,大小在250～1000bps之间,进一步对含有插入片段的近4000个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因。     

SARS病毒特异性靶基因的多重PCR检测技术研究

本研究探讨了多重PCR技术在SARS病毒检测中的应用。根据香港中文大学在GenBank上公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性样品,根据世界卫生组织推荐的进行单PCR与多重PCR检测分析。以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp的靶基因片段3条;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182b+302bp的靶基因片段组合;以二重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。结果表明:多重PCR技术可成功应用于SARS病毒的检测。     

芦荟耐盐差异表达基因文库的构建

为了弄清景天酸植物芦荟的耐盐、耐旱机理，应用抑制性消减杂交技术，构建了库拉索芦荟的盐诱导组织与正常组织差异表达的cDNA消减文库，并做了初步鉴定。分别从库拉索芦荟的正常叶片组织及高盐诱导叶片组织中提取poly(A)^ RNA，依次合成单链及双链cDNA，酶切成平均大小为400～600bp的片段；将高盐诱导组织eDNA分为两组，分别与两种不同的接头连接，再与正常组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR；获得的产物与T／A载体连接构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增。经检验证明，构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率，非特异性cDNA片段被有效地消减，而特异表达的cDNA得到富集。所构建的库拉索芦荟高盐诱导组织cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆高盐特异性表达的未知新基因奠定了基础。