表达重组谷氨酸脱羧酶工程菌发酵条件的优化

目的对表达谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,EC4.1.1.15,简称GAD或GDC)的重组大肠杆菌的发酵条件进行优化。方法通过单因素试验优化表达GAD的重组大肠杆菌B3C1的诱导剂IPTG添加时间、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度,再经响应面分析法优化工程菌的发酵条件(氯化钠、胰化蛋白胨、酵母粉、摇床转速、初始pH值、培养时间、接种量、装液量)。结果工程菌的最佳诱导条件为:IPTG添加时间为工程菌接种后4 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为35℃;工程菌的最佳发酵条件为:酵母粉1.01%,氯化钠0.6%,胰化蛋白胨1.5%,培养时间11.25 h,摇床转速250 r/min,初始pH值6.5,接种量3.0%,装液量11.70 ml。工程菌在该条件下发酵培养,GAD酶活达1 227.33 U,比优化前提高了12.29%。结论已成功对表达GAD的重组大肠杆菌的发酵条件进行了优化,为其工业化生产奠定了基础。     

重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺,为其规模化生产奠定基础。方法以目的蛋白的表达量及菌体浓度作为综合评价指标,对重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的摇瓶发酵温度、初始pH值、溶解氧、IPTG浓度及诱导时间进行优化;以摇瓶发酵结果为基础,进一步对发酵罐培养工艺中诱导时机、诱导时间及补料培养基配方进行优化;以确定的罐发酵工艺条件连续发酵5批,验证该发酵工艺。结果最适摇瓶发酵工艺条件为:发酵温度为37℃,初始pH值为7.0,高溶氧,IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L,诱导时间为4 h;最适罐发酵工艺条件为:菌体A600值约为40时开始诱导,诱导时间为4 h,补料培养基配方为葡萄糖25%,MgSO4.7H2O 0.5%。按照确定的工艺连续发酵5批,最终菌体A600均达50.0以上,目的蛋白的表达量均高于15%。结论优化的重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺稳定性良好,已达到中试生产规模的要求。     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

含抗菌肽CC31毕赤酵母工程菌培养基及其培养条件的优化

目的筛选毕赤酵母工程菌培养基的主要组分,优化工程菌培养条件。方法采用毕赤酵母工程菌CC31发酵培养抗菌肽CC31,选取基础盐培养基(basic salt medium,BSM)为初始培养基,利用单因素试验、正交试验设计对培养基的碳源、氮源、酵母营养物进行筛选;选取最适培养基对菌种接种量、培养基初始pH值、培养温度进行培养条件优化。结果经鉴定,抗菌肽CC31相对分子质量为13 620;初始BSM培养基添加组分中碳源为3%甘油和3%葡萄糖,酵母营养物为1%酵母浸出物,氮源为1. 5%硫酸铵;在10%接种量、培养基初始pH值为6,培养温度为30℃的培养条件下,获得的抗菌肽CC31蛋白浓度可达82 mg/L。结论优化了毕赤酵母工程菌培养基组分及培养条件,获得高表达量的重组蛋白,为工业化高密度发酵提供了实验依据。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

重组人uPA_(17)-KPI大规模发酵及纯化工艺的建立

目的建立重组人uPA17-KPI(rhuPA17-KPI)毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺。方法对工程菌表达rhuPA17-KPI的pH值进行优化。在摇瓶中制备rhuPA17-KPI工程菌种子2L,接种至80L发酵罐中,采用优化的pH值,补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,经甲醇诱导48h后结束发酵。将发酵液离心,经SP Sepharose XL阳离子交换层析和SourceTM 30 RPC反相疏水柱层析纯化。结果建立的发酵工艺为:控制发酵温度为28℃,pH值为5.5,溶氧值为25%～30%之间,在酵母细胞湿重达到190g/L时开始甲醇诱导表达,诱导30h,rhuPA17-KPI的分泌达高峰,为300mg/L发酵液。发酵上清经阳离子交换层析和反相疏水层析纯化后,获得纯度为95%以上的rhuPA17-KPI,产量为180mg/L,回收率为60%。结论已建立了rhuPA17-KPI毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺,为其产业化及临床应用奠定了基础。     

链球菌溶血素与真菌果胶酶融合表达及纯化条件的优化

目的优化链球菌溶血素(streptolysin O,SLO)与真菌果胶酶(pectin lyase,PL)的融合表达及纯化条件。方法将活化培养的工程菌以2%接种量接种于发酵液体培养基中,于37℃,200 r/min培养至不同生长期(A_(600)值分别为0.6、0.8和1.0),分别于不同温度(10、15、20、25、30、35和37℃)及加入不同终浓度IPTG(0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0 mmol/L)条件下诱导表达不同时间(6、12、20、24、36、48和60 h)。将诱导表达的融合蛋白进行Ni离子亲和层析纯化,对纯化中的上样缓冲液(binding buffer,分别含0、5、10、15、20、25、30 mmol/L咪唑)、清洗缓冲液(washing buffer,分别含0、5、10、20、30、40、50、60 mmol/L咪唑)及洗脱缓冲液(elution buffer,分别含100、200、500、1 000 mmol/L咪唑)的咪唑浓度进行优化。结果最佳诱导表达条件为:工程菌培养至A_(600)为0.8时,加入0.4 mmol/L IPTG,于20℃诱导24 h,目的蛋白的相对分子质量约91 500,占全菌总蛋白的38.6%,溶血活性可达4.0×10~7U/ml。最佳纯化条件为:binding buffer和washing buffer最佳咪唑浓度为5和60 mmol/L,elution buffer分别使用200和500 mmol/L咪唑进行阶段性梯度洗脱,纯化产物纯度可达95%。结论成功优化了SLO与PL融合蛋白的表达及纯化条件,纯化后获得了纯度较高的融合蛋白,为进一步研究SLO蛋白的性质及应用奠定了基础。     

表达重组人可溶性TRAIL的毕氏酵母发酵工艺

目的优化rhsTRAIL毕氏酵母工程菌在5L发酵罐中的发酵表达工艺参数。方法研究培养基种类、细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并用电镜观察其诱导肿瘤细胞凋亡特征。结果在无机盐培养基中,按10%接种A600=8～12的种菌后,24h酵母菌增殖至A600=76;甘油含量为1%时,菌体生长速度快(A600=160);培养基pH值5.0,甲醇终浓度为1%时,诱导96h表达量最高达到120mg/L,并具有诱导肿瘤细胞凋亡特征。结论rhsTRAIL毕氏酵母的发酵工艺参数为无机盐培养基,pH值5.0,接种10%A600=8～12的种菌,甘油含量1%,甲醇终浓度1%,诱导96h。     

重组免疫毒素IL-6_(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中自诱导表达条件的优化

目的优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量。方法采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性。结果确定最适自诱导培养条件为装瓶量20 ml/250 ml、接种量2%,28℃诱导25 h;最适自诱导培养基组分为:蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05%、甘露醇1%、乳糖0.6%、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87%提高至98%。结论优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白,为进一步研究其生物学活性及其应用奠定基础。方法以绿色微囊藻Microcystis viridis NIES-103基因组DNA为模板,PCR扩增MVL基因阅读框序列,并克隆至pET-30b(+)载体中,构建重组表达质粒pET-30b-MVL,经PCR、测序鉴定后,转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的蛋白采用Ni-NTA亲和柱层析纯化及复性。结果重组表达质粒pET-30b-MVL序列完整,插入的基因片段全长345bp,与GenBank中公布的MVL基因序列一致。重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导起始浓度A600=0.5左右,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导温度37℃,诱导时间4h,诱导培养基采用LB。以此条件诱导,在相对分子质量约20000处可见目的蛋白表达条带,表达量可占菌体总蛋白的47%,且表达蛋白主要以可溶性形式存在。纯化的重组蛋白纯度达95%以上,质谱鉴定为甘露糖结合凝集素。结论已成功地原核表达并纯化了绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白。     

PTD-SARA融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的在大肠杆菌中表达PTD-SARA融合蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法使用大肠杆菌偏爱密码子合成PTD-SARA全长基因,将其克隆入载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-PTD-SARA,转化感受态大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定及N-端测序。结果重组表达质粒pQE-30-PTD-SARA经双酶切及测序鉴定证明构建正确。1.0mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的25%,主要以包涵体形式存在。纯化的融合蛋白纯度为94%,浓度为0.2mg/ml,且具有良好的反应原性,N-端有14个氨基酸。结论已成功表达并纯化了PTD-SARA融合蛋白,为其功能的研究奠定了基础,也为临床防治肾脏纤维化提供了一个新的策略。     

重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中的表达及其细胞毒性

目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)、Rosettablue(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达产物经亲和层析纯化后,检测其细胞毒性。结果重组表达质粒pET-28a-hIL6(T22)-PE38经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组毒素相对分子质量约56 000,在大肠杆菌Rosettablue(DE3)中表达量最高。最适诱导表达条件为:1 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h。重组毒素能选择性地杀伤人骨髓瘤细胞U266和鼠骨髓瘤细胞SP2/0,体外对U266和SP2/0细胞的IC50分别为0.5～1.0和1.0～1.5μg/ml。结论重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中成功获得可溶性表达,纯化的蛋白可明显选择性杀伤U266和SP2/0细胞。     

日本血吸虫核酸疫苗质粒适宜宿主菌的筛选及其发酵条件的优化

目的筛选二价日本血吸虫核酸疫苗质粒的适宜宿主菌,并对其发酵条件进行优化。方法通过综合考察细胞干重、质粒DNA产量及工程菌传代的质粒稳定性等参数,确定适宜宿主菌及其相适应的发酵培养基碳源、氮源和磷酸盐类型;进一步通过中心组合设计响应面试验,优化发酵培养基,并对优化的发酵培养基进行实验验证。结果确定适宜宿主菌为E.coliDH5α,优化的发酵培养基(m/v)为:NaCl1.0%,Yeast Extract1.0%,磷酸盐0.3%[其中m(K2HPO4)∶m(KH2PO4)=1∶4],甘油1.68%,牛肉汁2.28%,豆饼汁4.21%。在此发酵条件下,菌体干重由原来的1.57mg/ml增长至5.68mg/ml,质粒DNA产量由原来的3.94μg/ml增长至36.52μg/ml。结论已筛选出日本血吸虫核酸疫苗质粒适宜宿主菌,并优化了其发酵条件,明显提高了质粒DNA产量,具有大规模发酵生产应用价值。     

人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因的克隆及原核表达

目的克隆人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法从人乳腺癌细胞系SK-Br3中扩增HER2胞外近膜区编码基因,克隆并测序后,插入原核表达质粒pET41d中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行纯化。结果从SK-Br3细胞系中扩增出387bp的人HER2胞外近膜区基因;重组表达质粒pET41d/HER2构建正确;IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高;纯化后重组蛋白浓度为1.5mg/ml。结论已成功表达了HER2胞外近膜区蛋白,为抗HER2单克隆抗体的制备提供了抗原。